一种固液结合制备布雷默浪丹的方法与流程

本发明属于多肽药物化学合成领域，涉及一种固液结合制备布雷默浪丹的方法。

背景技术：

布雷默浪丹pt141肽序为：ac-nle-cyclo(-asp-his-d-phe-arg-trp-lys)-oh，分子式：c50h68n14o10,分子量为1025.18，其结构式如下：

布雷默浪丹pt141，又称布美诺肽，是一种黑素皮质素受体-4(mc4r)激动剂，通过激活大脑中的内源性途径来调节性欲和性反应，帮助伴有低活跃性性欲障碍况的绝经前女性保持正常性欲，该多肽为美国palatintechnologies制药公司研发的一种治疗女性性功能障碍的新药，目前已完成临床iii期研究，已于2019年6月21日获fda批准上市。布雷默浪丹相比氟班色林有很大优势，不需要禁酒，没有低血压、眩晕等不良反应，仅有轻微恶心反应，起效迅速，30分钟起效，疗效持续8个小时，目前中国也未批准任何治疗hsdd的药物上市，因此布雷默浪丹有着广阔的市场前景。

目前国内关于布雷默浪丹合成的情况大致如下：如专利cn106589111a中报道，使用5+2片段合成，用到lys(ivdde)价格昂贵且大量不易获得，脱除侧链保护基ivdde使用到水合肼具有剧毒危险，操作困难且废液难处理，对环境污染大等，其中5+2片段中ac-nle-asp-otbu需要液相合成步骤繁多且不易得到高纯度片段，整体设计上操作繁琐，效率低下，不利于规模化生产，在专利cn101280005b中采用了价格昂贵的asp(o-2-phipr)，lys(mmt)树脂上选择性脱保护成环，收率只有17％左右，大规模生产成本高。

国外原研公司专利如us6579968、us6794489、us7176279、us7235625、us7417027及us7473760中，肽序列中lys侧链使用adpoc、alloc、mtt不常规保护基，在王树脂逐步偶联，该方法lys侧链特殊保护基，原料价格昂贵且市场上不易大量获得，用低浓度的tfa不将多肽从王树脂裂解下来的情况下选择性裂解lys侧链保护基(adpoc、alloc、mtt)，asp侧链保护基tbu，2-phipr树脂上成环后，再使用高浓度的tfa将多肽链从王树脂上裂解下来得到布雷默浪丹(pt114)粗品，该方法存在侧链氨基保护基mtt、羧基保护基tbu脱除不干净需要反复多次，脱除alloc需要使用昂贵的四(三苯基磷)钯，操作繁琐且产品容易引人重金属钯，树脂上低浓度的tfa选择性裂解侧链保护基又无法检测羧基保护基tbu是否脱完全，且整条多肽链容易从树脂上被裂解下来，不利于控制反应，这样会造成成本升高，不利于大量生产，因此需要一种固液相结合制备布雷默浪丹的方法对上述问题做出改善。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种固液结合制备布雷默浪丹的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种固液结合制备布雷默浪丹的方法，包括如下步骤：

s1，将fmoc-trp(boc)-oh连接到2-ctcresin载体上，依照fmoc固相多肽合成原理和肽序，合成六肽全保护片段ac-nle-asp(otbu)-his(trt)-d-phe-arg(pbf)-trp(boc)-oh；

s2，在液相体系下，将合成的六肽全保护片段与h-lys(boc)-ome.hcl通过缩合剂进行片段缩合，并用纯水沉降，过滤及干燥得到侧链带保护基的七肽甲酯ac-nle-asp(otbu)-his(trt)-d-phe-arg(pbf)-trp(boc)-lys(boc)-ome；

s3，全保护七肽甲酯使用切割液裂解侧链保护基，裂解完成后，反应液加入到冰冻mtbe或乙醚中，析出固体并过滤收集固体，干燥得到线性七肽甲酯，再将线性七肽甲酯溶于dmf/thf溶液中，序列中asp侧链羧基与lys侧链氨基用缩合剂成环，挤兑到冰冻mtbe或乙醚中，析出固体并过滤收集固体，干燥得到甲酯环肽ac-nle-cyclo(-asp-his-d-phe-arg-trp-lys)-ome；

s4，将甲酯环肽溶于acn/h2o溶液中，并使用dbu，通入n2保护并维持反应液在合适的温度，从而甲酯水解掉，反应液静置一会，分离出下层液，向其加入冰冻mtbe或乙醚打浆，析出产品并过滤，再用mtbe或乙醚打浆洗涤固体产品，过滤收集固体产品，干燥得到布雷默浪丹粗品。

优选的，所述s1，fmoc-trp(boc)-oh通过dipea作用连接到2-ctcresin载体上,且制得的fmoc-leu-ctc树脂替代度范围为0.30mmo/g～1.00mmol/g,优先选择0.50mmol/g～0.90mmol/g。

优选的，所述s1，合成全保护六肽片段时所使用的保护氨基酸如下：fmoc-arg(pbf)-oh,fmoc-d-phe-oh,fmoc-his(trt)-oh,fmoc-asp(otbu)-oh,fmoc-nle-oh，在合成全保护六肽时，氨基酸投料摩尔比为1.5～6倍，优先选择1.5～2.5倍。

优选的，所述s2，缩合剂可选用以下组合中的任意一种：dic/y,edc.hcl/y,hbtu/y/z,hatu/y/z,hctu/y/z,tbtu/y/z,pybop/y/z,pyaop/y/z；其中y＝hobt或hoat或cl-hobt,z＝dipea或nmm或tmp，优先选择dic/hobt或hbtu/cl-hobt/dipea或hbtu/hobt/dipea或hatu/hoat/tmp或pybop/nmm或hatu/dipea。

优选的，所述s2，六肽全保护片段与氨基酸h-lys(boc)-ome.hcl进行缩合时，全保护六肽与氨基酸的投料摩尔比为1～3倍，优先选择1～1.5倍；反应ph值为6～10，优先选择ph值为7～9；沉降时所使用的纯水用量为反应液体积的6～12倍，优先选择8～10倍。

优选的，所述s3，裂解时的裂解剂为三氟乙酸与水的混合物，三氟乙酸与茴香硫醚、水、edt、三异丙基硅烷的混合物或三氟乙酸与茴香硫醚、水、dodt、三异丙基硅烷的混合物，在全保护七肽使用切割液裂解侧链保护基时优先选择三氟乙酸与茴香硫醚、水、dodt、三异丙基硅烷的混合物，比例92.5％:2.5％:2.5％:2.5％。

优选的，所述s3，dmf浓度为40％～99％，优先选择40％，反应温度15～25℃，优先选择25℃，反应时间10～45h,沉降使用的mtbe或乙醚用量为滤液体积的6～12倍，优先选择8～10倍。

优选的，所述s4，dbu与甲酯环肽的摩尔量为5～10：1，优先选择5～6:1，其中反应体系acn/h2o溶液中acn浓度为70％～99％，优先选择acn浓度为80％，水解时的反应温度为0～20℃，优先选择0～5℃，反应时间为2～10h,沉降使用的mtbe或乙醚用量为滤液体积的5～12倍，优先选择5-7倍。

与现有技术相比，本发明提出了一种固液结合制备布雷默浪丹的方法，具有以下有益效果：

1、本发明使用固液结合法进行6+1片段缩合，操作工艺简单，粗品纯度和收率高，环境污染小，便于提高下游纯化收率和产品最终纯度，具有大规模生产的应用价值。

2、本发明中合成的粗品纯度≥70％，合成收率≥70％，且反应条件温和，操作简便，生产周期短，成本较低，环境污染小，便于规模化生产，有广泛的应用前景和较好的经济社会价值。

附图说明

图1为本发明一种固液结合制备布雷默浪丹的方法的工艺流程图；

图2为本发明一种固液结合制备布雷默浪丹的方法的布雷默浪丹(pt114)粗品hplc图：保留时间rt＝15.743min,纯度70％；

图3为本发明一种固液结合制备布雷默浪丹的方法的布雷默浪丹(pt114)粗品esi-ms图：[m+h]⁺＝1025.95,[m+2h]²⁺＝513.61；

图4为本发明一种固液结合制备布雷默浪丹的方法的缩写或英文全称示例图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参照图1-4，一种固液结合制备布雷默浪丹的方法，包括如下步骤：s1，将fmoc-trp(boc)-oh连接到2-ctcresin载体上，依照fmoc固相多肽合成原理和肽序，合成六肽全保护片段ac-nle-asp(otbu)-his(trt)-d-phe-arg(pbf)-trp(boc)-oh；

s2，在液相体系下，将合成的六肽全保护片段与h-lys(boc)-ome.hcl通过缩合剂进行片段缩合，并用纯水沉降，过滤及干燥得到侧链带保护基的七肽甲酯ac-nle-asp(otbu)-his(trt)-d-phe-arg(pbf)-trp(boc)-lys(boc)-ome；

s3，全保护七肽甲酯使用切割液裂解侧链保护基，裂解完成后，反应液加入到冰冻mtbe或乙醚中，析出固体并过滤收集固体，干燥得到线性七肽甲酯，再将线性七肽甲酯溶于dmf/thf溶液中，序列中asp侧链羧基与lys侧链氨基用缩合剂成环，挤兑到冰冻mtbe或乙醚中，析出固体并过滤收集固体，干燥得到甲酯环肽ac-nle-cyclo(-asp-his-d-phe-arg-trp-lys)-ome；

s4，将甲酯环肽溶于acn/h2o溶液中，并使用dbu，通入n2保护并维持反应液在合适的温度，从而甲酯水解掉，反应液静置一会，分离出下层液，向其加入冰冻mtbe或乙醚打浆，析出产品并过滤，再用mtbe或乙醚打浆洗涤固体产品，过滤收集固体产品，干燥得到布雷默浪丹粗品。

所述s1，fmoc-trp(boc)-oh通过dipea作用连接到2-ctcresin载体上,且制得的fmoc-leu-ctc树脂替代度范围为0.30mmo/g～1.00mmol/g,优先选择0.50mmol/g～0.90mmol/g。

所述s1，合成全保护六肽片段时所使用的保护氨基酸如下：fmoc-arg(pbf)-oh,fmoc-d-phe-oh,fmoc-his(trt)-oh,fmoc-asp(otbu)-oh,fmoc-nle-oh，在合成全保护六肽时，氨基酸投料摩尔比为1.5～6倍，优先选择1.5～2.5倍。

所述s2，缩合剂可选用以下组合中的任意一种：dic/y,edc.hcl/y,hbtu/y/z,hatu/y/z,hctu/y/z,tbtu/y/z,pybop/y/z,pyaop/y/z；其中y＝hobt或hoat或cl-hobt,z＝dipea或nmm或tmp，优先选择dic/hobt或hbtu/cl-hobt/dipea或hbtu/hobt/dipea或hatu/hoat/tmp或pybop/nmm或hatu/dipea。

所述s2，六肽全保护片段与氨基酸h-lys(boc)-ome.hcl进行缩合时，全保护六肽与氨基酸的投料摩尔比为1～3倍，优先选择1～1.5倍；反应ph值为6～10，优先选择ph值为7～9；沉降时所使用的纯水用量为反应液体积的6～12倍，优先选择8～10倍。

所述s3，裂解时的裂解剂为三氟乙酸与水的混合物，三氟乙酸与茴香硫醚、水、edt、三异丙基硅烷的混合物或三氟乙酸与茴香硫醚、水、dodt、三异丙基硅烷的混合物，在全保护七肽使用切割液裂解侧链保护基时优先选择三氟乙酸与茴香硫醚、水、dodt、三异丙基硅烷的混合物，比例92.5％:2.5％:2.5％:2.5％。

所述s3，dmf浓度为40％～99％，优先选择40％，反应温度15～25℃，优先选择25℃，反应时间10～45h,沉降使用的mtbe或乙醚用量为滤液体积的6～12倍，优先选择8～10倍。

所述s4，dbu与甲酯环肽的摩尔量为5～10：1，优先选择5～6:1，其中反应体系acn/h2o溶液中acn浓度为70％～99％，优先选择acn浓度为80％，水解时的反应温度为0～20℃，优先选择0～5℃，反应时间为2～10h,沉降使用的mtbe或乙醚用量为滤液体积的5～12倍，优先选择5～7倍。

具体实施方式：

实施例1

1.全保护六肽ac-nle-asp(otbu)-his(trt)-d-phe-arg(pbf)-trp(boc)-oh的合成

称取30.0g2-ctcresin(1.04mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入dcm溶涨30min，抽掉，称取19.716gfmoc-trp(boc)-oh并加入约120mldmf溶解同时冰水浴降温，加入5.434mldipea活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入3.804mldipea继续反应约1h，反应结束后，依次加入dmf，mtbe,dmf交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液dcm/meoh/dipea＝17/2/1(v/v/v)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min，封闭结束后，加入dmf洗涤，并用mtbe收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.54mmol/g。

称取37.04g(20mmol)fmoc-trp(boc)-ctcresin于多肽合成反应器中，加入dcm溶涨30min,抽掉，加入适量5％pip/2％dbu/1％hobt/dmf溶液脱保护两次，分别为10min,20min。加入dmf,meoh,dmf交替洗涤2轮，称取18.74gfmoc-arg(pbf)-oh,4.06ghobt于烧杯中，加入dmf溶解，再加入5.24mldipea在冰水浴条件下降温至0～5℃，最后加入11.38ghbtu活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全，反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为:fmoc-d-phe-oh,fmoc-his(trt)-oh,fmoc-asp(otbu)-oh,fmoc-nle-oh,偶联完成后脱除n末端fmoc保护基，以乙酸酐25.6ml、吡啶21.34ml、dmf213.4ml进行乙酰化，以茚三酮检测判定缩合是否完全，加入dmf,meoh,dmf交替洗涤2轮，再用dcm洗涤4次，干燥树脂，得到59.76g，收率：95.07％

将上述所得59.76g片段(1-6)肽树脂加入到600ml1％tfa/dcm(v/v)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体26.98g,测得esi-ms：[m+h]⁺＝1565.90。

2.6+1片段缩合

称取5.22g氨基酸h-lys(boc)-ome.hcl溶于20mldmf中并搅拌至溶解，加入dipea调ph至7，称取25.08g六肽全保护肽，2.85gcl-hobt于烧杯中并用100mldmf溶解，加入8.36mldipea并用冰盐浴降温至-5～0℃，再加入6.67ghbtu活化约10min,将其加入到氨基酸溶液中，-5～0℃反应3～4h,并控制反应ph值在7，可用hplc监控反应进程，反应结束后，将反应液加入到1.2l预先降温的冰水中，析出白色固体并过滤，用纯水洗涤固体3～4遍，将所得固体真空干燥至恒重，称量所得固体为27.78g，测得esi-ms：[m+h]⁺＝1808.21。

3.脱除侧链保护得到线性七肽甲酯，用缩合剂液相体系侧链成环

将上述所得25g全保护七肽ac-nle-asp(otbu)-his(trt)-d-phe-arg(pbf)-trp(boc)-lys(boc)-ome溶于250ml92.5％tfa/2.5％tis/2.5％h2o/2.5％mps溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度在25℃裂解，反应结束后，将反应溶液加入到1.95l冰冻mtbe中，析出固体并过滤，用mtbe洗涤固体3～4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得线性七肽甲酯固体重为14.1g,含4个tfa盐的分子量为：1513.22，测得esi-ms：[m+h]⁺＝1057.22。

将上述所得12g线性七肽甲酯ac-nle-asp-his-d-phe-arg-trp-lys-ome溶解在360ml40％dmf/thf溶液中，加入8.754mlnmm调节ph搅拌10min，称取16.525gpybop于圆底烧瓶中并用1800ml40％dmf/thf溶液溶解，再加入5.574mlnmm搅拌均匀，用恒压滴液漏斗将线性七肽甲酯溶液缓慢滴加到上述pybop/nmm的圆底烧瓶溶液中，滴加4h，反应通过hplc中控，反应45h后成环结束，将反应液在≤32℃下减压旋蒸掉thf，再加入到6.8l冰冻mtbe中，析出固体并过滤，用mtbe洗涤固体3～4遍，真空干燥至恒重，称量所得到的固体为9.83g,测得esi-ms：[m+h]⁺＝1039.21

4.环七肽甲酯水解

将上述所得9.5g环七肽甲酯ac-nle-cyclo(-asp-his-d-phe-arg-trp-lys)-ome溶解在285ml80％acn/h2o溶液中，搅拌至全溶解，冰水浴降温至0～5℃，加入5.7mldbu于环七肽甲酯溶液中，并用n2保护反应，反应温度维持在0～5℃，反应4-6h，可通过hplc监控反应进程，反应结束后，将溶液静置10min，分层，下层液加入720ml冰冻mtbe析出固体并打浆，用mtbe打浆洗涤固体3～4遍，过滤并收集固体至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重量为8.585g,测得esi-ms：[m+h]⁺＝1025.95,粗品hplc纯度为72％，收率为91.4％。

实施例2

1.全保护六肽ac-nle-asp(otbu)-his(trt)-d-phe-arg(pbf)-trp(boc)-oh的合成

称取30.0g2-ctcresin(1.04mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入dcm溶涨30min，抽掉，称取24.64gfmoc-trp(boc)-oh并加入约120mldmf溶解同时冰水浴降温，加入9.238mldipea活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入7.065mldipea继续反应约1h，反应结束后，依次加入dmf，mtbe,dmf交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液dcm/meoh/dipea＝17/2/1(v/v/v)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min，封闭结束后，加入dmf洗涤，并用mtbe收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.76mmol/g。

称取26.315g(20mmol)fmoc-trp(boc)-ctcresin于多肽合成反应器中，加入dcm溶涨30min,抽掉，加入适量5％pip/2％dbu/1％hobt/dmf溶液脱保护两次，分别为10min,20min。加入dmf,meoh,dmf交替洗涤2轮，称取25.92gfmoc-arg(pbf)-oh,5.41ghobt于烧杯中，加入dmf溶解，再加入6.194mldic在冰水浴条件下降温至0～5℃活化约3min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全，反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为:fmoc-d-phe-oh,fmoc-his(trt)-oh,fmoc-asp(otbu)-oh,fmoc-nle-oh,偶联完成后脱除n末端fmoc保护基，以乙酸酐20.7ml、吡啶17.26ml、dmf172.56ml进行乙酰化，以茚三酮检测判定缩合是否完全，加入dmf,meoh,dmf交替洗涤2轮，再用meoh洗涤4次，干燥树脂，得到48.55g，收率：93％。

将上述所得46.78g片段(1-6)肽树脂加入到470ml1％tfa/dcm(v/v)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体25.8g,测得esi-ms：[m+h]⁺＝1565.90。

2.6+1片段缩合

称取2.61g氨基酸h-lys(boc)-ome.hcl溶于12mldmf中并搅拌至溶解，加入tmp调ph至7，称取12.525g六肽全保护肽，1.15ghoat于烧杯中并用88mldmf溶解，加入3.19mltmp并用冰盐浴降温至-5～0℃，再加入3.495ghatu活化约10min,将其加入到氨基酸溶液中，-5～0℃反应3～4h,并控制反应ph值在7，可用hplc监控反应进程，反应结束后，将反应液加入到800ml预先降温的冰水中，析出白色固体并过滤，用纯水洗涤固体3～4遍，将所得固体真空干燥至恒重，称量所得固体为14.29g，测得esi-ms：[m+h]⁺＝1808.21。

3.脱除侧链保护得到线性七肽甲酯，用缩合剂液相体系侧链成环将上述所得14g全保护七肽ac-nle-asp(otbu)-his(trt)-d-phe-arg(pbf)-trp(boc)-lys(boc)-ome溶于140ml92.5％tfa/2.5％tis/2.5％h2o/2.5％mps溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度在25℃裂解，反应结束后，将反应溶液加入到1.95l冰冻mtbe中，析出固体并过滤，用mtbe洗涤固体3～4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得线性七肽甲酯固体重为7.78g,含4个tfa盐的分子量为：1513.22，测得esi-ms：[m+h]⁺＝1057.22。

将上述所得7.5g线性七肽甲酯ac-nle-asp-his-d-phe-arg-trp-lys-ome溶解在225ml40％dmf/thf溶液中，加入8.625mldipea调节ph搅拌5～10min，称取11.25ghatu于圆底烧瓶中并用1125ml40％dmf/thf溶液溶解，再加入5.175mldipea搅拌均匀，用恒压滴液漏斗将线性七肽甲酯溶液缓慢滴加到上述hatu/dipea的圆底烧瓶溶液中，滴加4h，反应通过hplc中控，反应12h后成环结束，将反应液在≤32℃下减压旋蒸掉thf，再加入到5.5l冰冻mtbe中，析出固体并过滤，用mtbe洗涤固体3～4遍，真空干燥至恒重，称量所得到的固体为5.96g,测得esi-ms：[m+h]⁺＝1039.21。

4.环七肽甲酯水解

将上述所得5.9g环七肽甲酯ac-nle-cyclo(-asp-his-d-phe-arg-trp-lys)-ome溶解在120ml80％acn/h2o溶液中，搅拌至全溶解，冰水浴降温至0～5℃，加入3.54mldbu于环七肽甲酯溶液中，并用n2保护反应，反应温度维持在0～5℃，反应4-6h，可通过hplc监控反应进程，反应结束后，将溶液静置10min，分层，下层液加入1.7l冰冻mtbe析出固体并打浆，用mtbe打浆洗涤固体3～4遍，过滤并收集固体至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重量为5.25g,测得esi-ms：[m+h]⁺＝1025.95,粗品hplc纯度为71.3％，收率为90.1％。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。