一种大肠杆菌环腺苷酸受体蛋白突变体、基因工程菌及应用的制作方法

本发明涉及基因工程
技术领域：
，特别是涉及一种大肠杆菌环腺苷酸受体蛋白突变体、基因工程菌及应用。
背景技术：
：木糖醇作为一种天然存在的五碳糖醇，是一种白色的粉末状晶体，存在于许多植物和微生物体内，同时在人体的正常代谢中间产物中，也有木糖醇的存在。木糖醇在食品、医药、化妆品和保健品中都有广泛的应用。目前利用枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母以及大肠杆菌作为宿主生产木糖醇均有报道。其中大肠杆菌因其可以利用五碳糖和六碳糖、生长速度快且基因编辑方法成熟等优点，在代谢工程和合成生物学领域作为最理想的一种菌株被广泛研究。申请人在公开号为cn105671013a的发明专利申请中公开了一种木糖还原酶突变体和基因工程菌，该木糖还原酶突变体来源为粗糙脉孢菌的木糖还原酶的8个氨基酸分别进行突变，8个氨基酸分别突变为：l102v，l107m，l109q，i110c，v114i，ksn271-273rtt，获得的木糖还原酶突变体命名为xr-8m，经过突变后所得的木糖还原酶突变体降低了催化阿拉伯糖为阿拉伯糖醇的活性，提高了其转化木糖醇的选择性。申请人在公开号为cn104789586a的发明专利申请中公开了：将插入序列is5与r6k复制子、氯霉素抗性基因连接，然后与启动子p43、xr和终止子连接构建获得重组质粒prc43。提取质粒prc43，以hk401菌株为多拷贝整合宿主进行转化，获得的菌株再制备成感受态，导入pcp20质粒，借助frt位点将菌体携带的氯霉素抗性基因删除，如此往复获得不同拷贝数的菌株is5-1，is5-2，is5-3，is5-4，is5-5，is5-6，经验证当拷贝数达到5个时，菌株生产木糖的能力较优。虽然，δptsg(敲除ptsg基因)的大肠杆菌is5-5菌株基本消除了ccr效应，实现了葡萄糖和木糖混合糖的同时利用，利用is5-5由玉米棒芯半纤维素水解液发酵高效生产木糖醇。然而，is5-5菌株尚未完全消除ccr效应，转运和转化木糖速率还不够高，木糖醇浓度和生产效率仍有待进一步提高。特别地，所用的半纤维素水解液原料需经过离子交换脱除毒物及抑制因子，此过程不但耗时，增加成本，而且产生大量废水，污染环境。通过基因工程技术使菌株彻底消除ccr效应，大幅提高木糖醇浓度和生产效率，同时提高其对水解液原料中毒物和抑制因子的耐受性，直接利用离子交换前的半纤维素水解液高效生产木糖醇，将创造巨大的经济效益和环保价值。技术实现要素：本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种大肠杆菌环腺苷酸受体蛋白突变体、基因工程菌及应用。一种大肠杆菌环腺苷酸受体蛋白突变体(简称crpg)，氨基酸序列如seqidno.1所示，由大肠杆菌的环腺苷酸受体蛋白(crp)112位氨基酸i突变为l、127位t突变为g、144位a突变为t得到。本发明又提供了所述大肠杆菌环腺苷酸受体蛋白突变体的编码基因。优选的，所述编码基因的基因序列如seqidno.2所示。野生型crp基因的序列如seqidno.3所示。本发明又提供了所述的大肠杆菌环腺苷酸受体蛋白突变体或所述编码基因在由玉米芯水解液生产木糖醇中的应用。本发明还提供了一种基因工程菌，将大肠杆菌的环腺苷酸受体蛋白112位氨基酸i突变为l、127位t突变为g、144位a突变为t。优选的，所述大肠杆菌的ptsg基因被敲除(简称δptsg)。更优选的，所述大肠杆菌的ptsf基因、xyla基因和xylb基因被敲除。进一步优选的，所述的基因工程菌，由大肠杆菌菌株is5-5将环腺苷酸受体蛋白112位氨基酸i突变为l、127位t突变为g、144位a突变为t得到。菌株is5-5是由w3110敲除了ptsg基因、ptsf基因、xyla基因和xylb基因作为底盘细胞，再插入5个拷贝的木糖还原酶表达模块构建的(详见公开号为cn104789586a的发明专利申请)。本发明还提供了所述基因工程菌在生产木糖醇中的应用。优选的，生产木糖醇的原料为未经离子交换处理的玉米芯水解液。本发明通过将大肠杆菌的环腺苷酸受体蛋白(crp)112位氨基酸i突变为l、127位t突变为g、144位a突变为t获得crpg菌株，与ptsg基因敲除的δptsg方案组合应用于生产木糖醇的大肠杆菌，菌株彻底消除ccr效应，大幅提高木糖醇浓度和生产效率，同时提高其对水解液原料中毒物和抑制因子的耐受性，直接利用离子交换前的半纤维素水解液高效生产木糖醇，简化原料处理工艺，减少设备投入，降低生产成本，减少污水排放。附图说明图1为野生大肠杆菌w3110菌株利用葡萄糖和木糖混合糖曲线图。图2为w3110g菌株利用葡萄糖和木糖混合糖曲线图。图3为w3110δptsg菌株利用葡萄糖和木糖混合糖曲线图。图4为w3110gδptsg菌株利用葡萄糖和木糖混合糖曲线图。图5为is5-5菌株利用葡萄糖和木糖混合糖摇瓶发酵生产木糖醇曲线图。图6为is5-5g菌株利用葡萄糖和木糖混合糖摇瓶发酵生产木糖醇曲线图。图7为is5-5菌株利用离交前的玉米芯半纤维素水解液15-l罐发酵生产木糖醇的浓度-时间关系曲线图。图8为is5-5g菌株利用离交前的玉米芯半纤维素水解液15-l罐发酵生产木糖醇的浓度-时间关系曲线图。具体实施方式本发明是在申请号为201510196843.8、名为“大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用”发明专利申请的基础上做的进一步研究。本申请中用到的克隆用菌株为大肠杆菌dh5α，表达用菌株为大肠杆菌w3110，基因改造出发菌株为is5-5(详见申请号为201510196843.8的前期申请，由大肠杆菌w3110在敲除ptsg基因、xyla基因、xylb基因和ptsf基因基础上，再插入5个拷贝的木糖还原酶表达模块获得)，均为本实验室保藏。crispr/cas9基因编辑所用质粒pcas及ptargetf为中国科学院上海植生所杨晟研究员惠赠。菌株构建所用引物如表1所示。表1基因编辑所用引物。primerssequence(5’-3’)n20-crp-fccgtcacgtcgaggaacgccgttttagagctagaaatagcaagn20-crp-rggcgttcctcgacgtgacggactagtattatacctaggactgagcn20check-fcgccacctctgacttgagcgn20check-rcgatgacgccaactacctctgcrpg-u-fgcatggtgcttggcaaaccgccrpg-u-rcccactttctctgagccgacttgcagacgacgcgccatctgtgcagacaaacgcatcaggaggtccgggtttacctgaatcaattgcrpg-d-fcgtctgcaagtcggctcagagaaagtgggcaatctggcgttcctcgacgtgacgggccgcattactcagactctgctgaatctggccrpg-d-rcatgtatcccgccaaactgagggcrp-check-fgctctggagaaagcttataacagaggcrp-check-rgtgcccaacgcatagatgagcaac试剂：酵母粉(yeastextraction)及蛋白胨(tryptone)：英国oxoid公司琼脂糖：上海生工葡萄糖，琼脂粉：国药集团化学试剂有限公司异丙基硫代-p-d-半乳糖苷(iptg)：美国gen-view公司氨苄青霉素，硫酸链霉素，硫酸卡纳霉素，氯霉素：美国gen-view公司木糖、阿拉伯糖、木糖醇、阿拉伯糖醇：上海阿拉丁生化科技股份有限公司3-吗啉丙磺酸(mops)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司还原型辅酶ii(nadph)：美国gen-view公司常用试剂盒：质粒小提试剂盒：康宁生命科学(吴江)有限公司基因组dna抽提试剂盒：康宁生命科学(吴江)有限公司dna凝胶回收试剂盒：康宁生命科学(吴江)有限公司大肠杆菌感受态细胞制作试剂盒：大连takara公司pcr相关试剂及产品：大连takara公司。常用试剂和培养基配方：1000×tracemetals组成(l-1)：fecl31.6g，cocl2·6h2o0.2g，cucl20.1g，zncl2·4h2o0.2g，namoo40.2g，h3bo30.05g，使用0.1mhcl配制。luria-bertani(lb)培养基组成(l-1)：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，去离子水溶解后，用5mnaoh调节ph值至7.0，121℃灭菌20min。lb固体培养基添加2％琼脂粉。摇瓶发酵培养基组成(l-1)：na2hpo46g，kh2po43g，nh4cl1g，nacl0.5g，1mmmgso4，1mmcacl2，酵母粉5g，1ml1,000×tracemetals，50mmmops(ph7.4，用于维持ph稳定)。实施例1以is5-5为出发菌株，采用crispr/cas9方法构建is5-5g菌株(环腺苷酸受体蛋白crp的i112l、t127g、a144t三位点突变)的步骤如下：1)ptarget-g质粒的构建首先需要在目标基因上找到一个pam位点，确定对应的n20序列，并将ptargetf质粒上的cadaspacer替换为目的基因的n20序列。以n20-crp-f/n20-crp-r为引物，ptargetf质粒为模板全质粒突变pcr构建ptarget-g质粒。2)修复模板构建以大肠杆菌w3110基因组为模板，crpg-u-f和crpg-u-r为引物扩增上游同源臂，crpg-d-f和crpg-d-r为引物扩增下游同源臂，跑核酸电泳并用相关试剂盒回收。然后以crpg-u-f和crpg-d-r为引物，上下游同源臂的等比例混合物为模板，进行重叠延伸pcr，切胶回收对应长度的片段，获得突变127位点基因的修复模板。3)热激法转入pcas质粒a.将保存在-80℃的is5-5划线在无抗的固体培养基平板上，过夜37℃培养。挑取单菌落于液体lb培养基中37℃，200rpm培养约10h，转接1ml菌液到装有50ml液体lb培养基的250ml三角瓶中，生长至od600到0.6-0.8，将菌液冰浴10min，按照takara大肠杆菌感受态试剂盒制备化转感受态。b.将制备好的is5-5感受态置于冰上，融化后在无菌条件下加入2μlpcas质粒，混匀后置于冰浴放置30min。c.42℃下水浴或金属浴热激90s，立即冰浴2min。d.加入700μl液体lb或复苏培养基，于30℃，200rpm复苏50min。e.吸取100μl复苏后的菌液，涂布于含有50mg/l的kanr的固体lb平板上，30℃培养过夜。f.挑取单克隆的菌落进行pcr或提取质粒验证，获得转化成功的大肠杆菌is5-5pcas。4)电转化定点突变的ptargetf和修复模板donordnaa.将1)中得到的大肠杆菌为出发菌株，划线于50mg/l的硫酸卡那霉素抗性的平板上，30℃培养过夜后(后续培养均需加入相同浓度的同种抗生素)，挑取单菌落至液体lb中，30℃，200rpm培养10-12h，转接1ml至50ml中lb中，30℃，200rpm培养1h后，加入工作浓度为0.5％灭菌的l-阿拉伯糖进行诱导表达red重组蛋白，继续培养至od600至0.6～0.8(约3h左右)，冰浴10min，进行电转感受态的制备。b.使用灭菌好的10mlep管，菌液分装10ml一管，4℃，4000rpm下离心5min，弃上清。c.用1ml预冷过的灭菌的10％的甘油重悬，4℃，4000rpm下离心10min，小心的弃去上清。d.重复c步骤2次。(后续沉淀容易随着上清流出，弃上清时需缓慢小心)e.用100μl10％的甘油重悬，转移至灭菌的1.5mlep管中，立即使用或置于-80℃冰箱中备用。(感受态最好现做现用，最长时间不可放置超过72h，否则转化效率会急剧下降)f.使用制备好的感受态或从-80℃中取出预先制备的感受态，冰上放置5min，加入400ng构建好点突变g的ptargetf质粒和800ng修复模板。混匀后转移至无菌的2mm电转杯中，冰上放置10min，进行电转化。g.电转条件：2.5kv，25μf，200ω，电转时间5ms左右。h.电转结束之后，立即加入1ml新鲜的液体lb，用移液枪来回吹打混匀后，转移至2ml灭菌的ep管中。在30℃，150rpm下复苏约2h。i.将复苏后的菌液离心浓缩后全部涂布于含有50mg/l的kanr和50mg/l的specr平板，30℃过夜培养。j.挑单菌落至含50mg/l的kanr和0.5mm的iptg的lb，在30℃，200rpm下培养12小时左右，消除ptarget质粒。k.基因编辑的验证。对于点突变成功的阳性转化子，采用pcr产物测序的方式来鉴定。l.根据需要，在30℃，200rpm下培养12小时左右可消除温敏型质粒pcas。采用crispr/cas9方法构建其他菌株的步骤与上述类似。实施例2以w3110菌株为出发菌株，采用crispr/cas9方法构建w3110g菌株(环腺苷酸受体蛋白crp的i112l、t127g、a144t三位点突变)。采用crispr/cas9方法构建时，方法同实施例1中相同，使用到的引物和质粒与实施例1中步骤(1)和(2)中ptarget-g质粒、修复模板相同。实施例3以大肠杆菌w3110为出发菌株，采用crispr/cas9方法构建w3110δptsg菌株(敲除ptsg基因)，步骤如下：以n20-ptsg-f/n20-ptsg-r为引物，ptargetf质粒为模板全质粒突变pcr构建ptarget-ptsg质粒。以大肠杆菌w3110基因组为模板，del-ptsg-u-f和del-ptsg-u-r为引物扩增上游同源臂，del-ptsg-d-f和del-ptsg-d-r为引物扩增下游同源臂，跑核酸电泳并用相关试剂盒回收。然后以del-ptsg-u-f和del-ptsg-d-r为引物，上下游同源臂的等比例混合物为模板，进行重叠延伸pcr，切胶回收对应长度的片段，获得敲除ptsg基因的修复模板。菌株构建所用引物如表2所示。表2基因编辑所用引物。实施例4以w3110g菌株(实施例2构建)为出发菌株，采用crispr/cas9方法构建w3110gδptsg菌株(环腺苷酸受体蛋白crp的i112l、t127g、a144t三位点突变，然后敲除ptsg基因)。采用crispr/cas9方法构建时，方法同实施例3中相同，使用到的引物和质粒与实施例3中步骤中ptarget-g质粒、修复模板相同。实施例51、摇瓶发酵配制摇瓶发酵培养基，250ml三角瓶中装液量45ml，接种1ml的种子液，37℃，200rpm培养4h，添加5ml灭菌后的浓缩玉米芯水解液(含有200g/l木糖和100g/l的葡萄糖，计算的木糖终浓度为20g/l，葡萄糖终浓度为10g/l)。30℃，200rpm下进行摇瓶发酵，定时取样并检测相关参数变化情况。同时每组实验均包含3个平行实验。2、上罐发酵(1)原料及仪器1)发酵原料：浙江华康药业提供的未经离子交换的玉米棒芯半纤维素水解液(初始ph2.5，用1m的naoh中和至6.4后60℃真空浓缩，木糖，葡萄糖与阿拉伯糖浓度分别为：550g/l，35g/l与45g/l)；2)lb平板固体培养基(g/l)：酵母粉5，蛋白胨10，nacl10，琼脂粉1.8％(质量分数)；一级种子培养基(lb培养基，g/l)：酵母粉5，蛋白胨10，nacl10；二级种子培养基(g/l)：酵母粉7.5，蛋白胨7.5，葡萄糖15，nacl10；发酵培养基(g/l)：葡萄糖10，玉米浆干粉24，nacl0.5，kh2po43，na2hpo4·12h2o9，nh4cl1。葡萄糖单独灭菌。3)实验仪器：10l旋转蒸发仪；国强15-l机械搅拌通气式发酵罐；agilent1260hplc；elsd检测器；bio-redhpx87c分析柱(2)实验方法1)半纤维素水解液的浓缩：采用真空减压浓缩原理，用旋转蒸发仪将水解液浓缩至木糖浓度大约为550g/l，备用。2)菌株活化：取甘油管保藏菌株，于lb固体培养基平板划线，37℃培养～12h。3)一级种子的制备：挑取lb平板上的单菌落，接入5mllb培养基的试管，37℃，200rpm培养过夜。4)二级种子的制备：吸取2ml菌液接种到含有300ml种子培养基的1l三角瓶中，37℃，200rpm培养10h，至od600为6左右。5)接种：在发酵罐中装入5.5l发酵培养基(除葡萄糖)，121℃灭菌30min，冷却至30℃，调节ph至7.0。采用火焰接种法接入发酵种子(约600ml)与灭好的葡萄糖溶液，此时罐中体积约为7l。6)原料的制备：取浓缩好的半纤维素水解液。根据终体积为10l左右，量取2.5l水解液(木糖质量为1370g)，115℃灭菌30min，第一次补料木糖浓度75g/l，第二次补料木糖浓度76g/l。按木糖与葡萄糖质量比为1∶0.6再称量一定量葡萄糖，溶解，115℃单独灭菌30min，准备连续流加补料。氮源的配制：称取160g玉米浆干粉两份，溶解，115℃灭菌30min。7)补料：接种后，控制ph为7.0，温度为30℃。通气量为0.6vvm，初始转速为400rpm，初始溶氧设定为30，培养9h左右至od大于20时补料。采用火焰接种法，加入配好的原料与氮源，葡萄糖采用流加补料。补料后控制ph为7.0，溶氧设定为20-25。8)放罐：根据ph变化确定发酵终点，当ph上升、溶氧上升时，取样hplc分析，若木糖醇浓度不再增加，则发酵停止。3、糖和糖醇的液相检测方法将所取的样品进行适当浓度的稀释后，使用0.22μm的过滤头进行过滤。利用dionexultimate3000高效液相系统对木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖醇和阿拉伯糖醇进行定量检测。检测器：coronachargedaerosoldetector(cad)，分析柱：aminexhpx-87c(φ7.8mm×300mm)，流动相：超纯水，流速：0.6ml/min，柱温设定：76℃。4、结果野生型大肠杆菌w3110菌株表现出明显的ccr效应，在葡萄糖存在的条件下完全不利用木糖(图1)；w3110g菌株在一定程度上缓解了ccr效应(图2)；w3110δptsg菌株大体上消除了ccr效应(图3)；w3110gδptsg菌株消除了ccr效应，实现了木糖与葡萄糖同步利用(图4)，表明crpg突变(环腺苷酸受体蛋白crp的i112l、t127g、a144t三位点突变)和δptsg(敲除ptsg基因)组合策略确实能够消除大肠杆菌的ccr效应。is5-5(δptsg)产生了17.8g/l的木糖醇(图5)；is5-5g(δptsg+crpg突变)产生了20.2g/l的木糖醇(图6)，表明采用crpg突变和δptsg组合策略确实能有效提高摇瓶发酵条件下菌株生产木糖醇的能力。is5-5和is5-5g菌株分别采用15-l罐分批补料进行发酵，利用未经离子交换的玉米棒芯半纤维素水解液。is5-5菌株78h生产了93g/l的木糖醇，生产速率为1.19g/l，木糖醇对木糖的收率为0.87g/g(图7)。is5-5g菌株78h生产了136.7g/l的木糖醇，生产速率为1.75g/l，木糖醇对木糖的收率为1.0g/g(图8)，这些结果相比出发菌株is5-5均有大幅提高。序列表<110>浙江大学<120>一种大肠杆菌环腺苷酸受体蛋白突变体、基因工程菌及应用<160>21<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>210<212>prt<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<400>1metvalleuglylysproglnthraspprothrleuglutrppheleu151015serhiscyshisilehislystyrproserlysserlysleuilehis202530glnglyglulysalagluthrleutyrtyrilevallysglyserval354045alavalleuilelysaspglugluglylysglumetileleusertyr505560leuasnglnglyasppheileglygluleuglyleuphegluglugly65707580glngluargseralatrpvalargalalysthralacysgluvalala859095gluilesertyrlyslyspheargglnleuileglnvalasnproasp100105110leuleumetargleuseralaglnmetalaargargleuglnvalgly115120125serglulysvalglyasnleualapheleuaspvalthrglyargile130135140thrglnthrleuleuasnleualalysglnproaspalametthrhis145150155160proaspglymetglnilelysilethrargglngluileglyglnile165170175valglycysserarggluthrvalglyargileleulysmetleuglu180185190aspglnasnleuileseralahisglylysthrilevalvaltyrgly195200205thrarg210<210>2<211>633<212>dna<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<400>2atggtgcttggcaaaccgcaaacagacccgactctcgaatggttcttgtctcattgccac60attcataagtacccatccaagagcaagcttattcaccagggtgaaaaagcggaaacgctg120tactacatcgttaaaggctctgtggcagtgctgatcaaagacgaagagggtaaagaaatg180atcctctcctatctgaatcagggtgattttattggcgaactgggcctgtttgaagagggc240caggaacgtagcgcatgggtacgtgcgaaaaccgcctgtgaagtggctgaaatttcgtac300aaaaaatttcgccaattgattcaggtaaacccggacctcctgatgcgtttgtctgcacag360atggcgcgtcgtctgcaagtcggctcagagaaagtgggcaatcttgcgttcctcgacgtg420acgggccgcattactcagactctgctgaatctggcaaaacaaccagacgctatgactcac480ccggacggtatgcaaatcaaaattacccgtcaggaaattggtcagattgtcggctgttct540cgtgaaaccgtgggacgcattctgaagatgctggaagatcagaacctgatctccgcacac600ggtaaaaccatcgtcgtttacggcactcgttaa633<210>3<211>633<212>dna<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<400>3atggtgcttggcaaaccgcaaacagacccgactctcgaatggttcttgtctcattgccac60attcataagtacccatccaagagcaagcttattcaccagggtgaaaaagcggaaacgctg120tactacatcgttaaaggctctgtggcagtgctgatcaaagacgaagagggtaaagaaatg180atcctctcctatctgaatcagggtgattttattggcgaactgggcctgtttgaagagggc240caggaacgtagcgcatgggtacgtgcgaaaaccgcctgtgaagtggctgaaatttcgtac300aaaaaatttcgccaattgattcaggtaaacccggacattctgatgcgtttgtctgcacag360atggcgcgtcgtctgcaagtcactt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