一种模拟体内微环境的胰腺导管上皮细胞和胰腺腺泡细胞共培养体系的构建方法与流程

本发明涉及一种模拟体内微环境的胰腺导管上皮细胞和胰腺腺泡细胞共培养体系的构建方法，属于细胞生物学技术领域。

背景技术：

急性胰腺炎(ap)是一种常见的以胰腺实质细胞损伤和炎性级联反应为主要特征的消化系统疾病。ap的全球年发病率高达13-45/10万人。其中，约80％的急性胰腺炎为轻度自限性疾病，预后较好，但仍有约20-30％的重症急性胰腺炎病情持续进展为全身炎症反应综合征或多器官功能衰竭，病死率高达10-30％。胆源性属于重症急性胰腺炎发生的主要因素，胆道结石、炎症等可引起胰管梗阻，胰黏膜屏障损害，胰液外溢，引起胰腺组织自我消化，形成急性胆源性胰腺炎。

胰腺导管上皮细胞数量约占胰腺细胞总数的10％，占胰腺体积的4％。胰腺导管上皮细胞可分泌富含hco3－的等渗液体，这种特性可使胰液作为胰腺腺泡分泌的蛋白质的载体，亦可中和十二指肠液的酸性提高其ph值水平，在人类正常生理方面具有十分重要的意义。针对sap患者的临床观察发现，胰管似乎最容易受到胆石症和内镜逆行胰管造影术的伤害性刺激，因此我们推断导管上皮是最容易暴露于胰腺炎常见伤害性刺激的细胞类型。若胰腺小叶间及小叶内导管受损，富含hco3－的胰液排出受限，可造成胰腺导管内蛋白栓形成，阻塞胰管，影响胰液排出，诱发胰腺炎。值得注意的是，john等研究发现内毒素和tnf-α体外刺激胰腺导管细胞系，损伤细胞生成并分泌了以il-6和il-1为主的大量炎性因子。

胰腺外分泌部由腺泡和导管共同组成，既往ap相关研究均聚焦于胰腺腺泡细胞，我们研究认为，经典的胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠法建立ap模型，胰管瞬时高压及外源性刺激首先会引起胰腺导管上皮细胞损伤，胰黏膜屏障损害，胰液外溢，进而引起胰腺腺泡内胰蛋白酶原异常激活为胰蛋白酶，导致胰腺自我消化。但目前尚无将胰腺腺泡细胞与导管细胞相关联的研究报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种模拟体内微环境的胰腺导管上皮细胞和胰腺腺泡细胞共培养体系的构建方法，该共培养体系可以提供一种新的胆源性胰腺炎体外细胞模型。

本发明提供了一种模拟体内微环境的胰腺导管上皮细胞和胰腺腺泡细胞共培养体系的构建方法，包括如下步骤：

(1)前期准备：预处理transwell细胞小室，并将原代小鼠胰腺腺泡细胞和人胰腺导管上皮细胞进行预培养；

(2)取原代小鼠胰腺腺泡细胞上清液转移到transwell双层培养室上层中，培养24h后用pbs清洗未贴壁的细胞，加入培养基；

(3)用胰酶消化人胰腺导管上皮细胞，重新接种到transwell双层培养室下层，加入培养基，插入transwell上层小室，37℃，5％co2培养箱中共培养24h；

(4)向transwell双层培养室下层的胰腺导管上皮细胞中加入1mm牛磺胆酸钠，1h后更换培养基，继续于37℃，5％co2培养箱中培养24h；

(5)观察上层胰腺腺泡细胞活力、形态、凋亡。

进一步地，上述技术方案中，所述预处理transwell细胞小室的方法为：将transwell细胞小室用i型胶原蛋白包被18-24h，用pbs清洗后备用。

进一步地，上述技术方案中，所述原代小鼠胰腺腺泡细胞的预培养方法为：将原代小鼠胰腺腺泡细胞接种于孔板中，加入含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素，0.25mg/ml胰蛋白酶抑制剂和25ng/ml重组人表皮生长因子混合物的waymouth培养基后，于37℃，5％co2培养箱中培养12-24h。

进一步地，上述技术方案中，所述人胰腺导管上皮细胞的预培养方法为：将人胰腺导管上皮细胞接种于孔板中，加入含10％胎牛血清的高糖dmem培养基在37℃，5％co2培养箱中培养18-24h。

进一步地，上述技术方案中，原代小鼠胰腺腺泡细胞接种于transwell双层培养室上层的接种密度为1×10⁵个/ml；人胰腺导管上皮细胞接种于transwell双层培养室下层的接种密度为1×10⁵个/ml。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中用pbs清洗未贴壁的细胞次数为3-4次。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中的培养基为含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素，0.25mg/ml胰蛋白酶抑制剂和25ng/ml重组人表皮生长因子混合物的waymouth培养基。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(3)和步骤(4)中的培养基均为含10％胎牛血清的高糖dmem培养基。

进一步地，上述技术方案中，所述的transwell双层培养室在上层与下层之间设置的半透膜的孔径为0.4μm。

本发明还提供了采用上述构建方法构建的胰腺炎体外细胞模型。

发明有益效果

本发明旨在构建一种模拟体内微环境的胰腺导管上皮细胞和胰腺腺泡细胞共培养体系，用于提供一种新的胆源性胰腺炎体外细胞模型。

本发明打破单一细胞研究的固有思路，把胰腺导管上皮细胞损伤与胰腺腺泡细胞结合起来，采用非接触式共培养方式搭建胰腺导管上皮细胞和胰腺腺泡细胞共培养体系。通过调整共培养所用的培养基，既适于胰腺腺泡细胞生长，又适于胰腺导管上皮细胞生长。共培养体系中上述两种细胞可以通过transwell跨膜交换胞外分泌物质。该体系能够更好地模拟胆汁淤积诱导的胰腺炎，提供了一种更真实反映胆汁淤积诱导胰腺炎的体外细胞模型。

附图说明

图1为模拟体内微环境的胰腺导管上皮细胞和胰腺腺泡细胞共培养体系模型。

图2为共培养体系中，牛磺胆酸钠诱导的胰腺导管上皮细胞损伤对胰腺腺泡细胞活力的影响；对照组：胰腺导管上皮细胞未经任何处理；处理组：胰腺导管上皮细胞经1mm牛磺胆酸钠刺激。

图3为共培养体系中，牛磺胆酸钠诱导的胰腺导管上皮细胞损伤对胰腺腺泡细胞形态(腺泡-导管化生)的影响；对照组：胰腺导管上皮细胞未经任何处理；处理组：胰腺导管上皮细胞经1mm牛磺胆酸钠刺激；amylase：淀粉酶；ck19：细胞角蛋白；hoechst33342：活细胞标记染料。

图4为共培养体系中，牛磺胆酸钠诱导的胰腺导管上皮细胞损伤对胰腺腺泡细胞凋亡的影响。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

本发明的胰腺导管上皮细胞和胰腺腺泡细胞共培养体系的建立方法，包括以下步骤：

预处理transwell细胞小室：将transwell细胞小室用i型胶原蛋白(货号：c8062，北京索莱宝科技有限公司)包被18-24h，用pbs清洗后备用。

从实验动物中提取分离原代胰腺腺泡细胞；培养hpde6-c7人正常胰腺导管上皮细胞系；将重悬沉淀后的胰腺腺泡细胞接种到transwell双层培养室上层，将导管上皮细胞接种到transwell双层培养室下层，建立胰腺导管上皮细胞和胰腺腺泡细胞共培养体系；给予下层胰腺导管上皮细胞1mmol牛磺胆酸钠刺激，1h后更换新鲜培养液，加药刺激24h后观察胰腺腺泡细胞活力、形态、凋亡等指标。

原代胰腺细胞分离、重悬沉淀及接种培养：取4-6周的雄性c57bl/6小鼠无菌处死并分离胰腺，经pbs充分漂洗后迅速转移至消化液(添加200u/ml胶原蛋白酶ia(货号：c9891，sigma公司)，0.25mg/ml胰蛋白酶抑制剂(货号：17075029，thermofisher公司)的hbss溶液，10nmhepes调节ph值＝7)中并剪碎成直径1mm的组织块，37℃孵育20-30分钟。在此期间(每5分钟)，通过移液枪(1000μl)反复吹散胰腺碎片约10次，进行机械分离。向具有胰腺碎片的消化液中加入含10％胎牛血清的高糖dmem培养基以终止消化，放入离心机离心300g，3分钟，弃上清，用含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素，0.25mg/ml胰蛋白酶抑制剂和25ng/ml重组人表皮生长因子混合物的waymouth培养基重悬沉淀，加入6孔板中，每孔加入1ml，37℃孵育12-24h。然后从6孔板中将上清液(胰腺腺泡细胞)吸出，以1×10⁵个/ml密度接种于transwell双层培养室上层。

人胰腺导管上皮细胞培养：将人胰腺导管上皮细胞接种于6孔板，用含10％胎牛血清的dmem高糖培养基，在37℃，5％co2培养箱中培养18-24h。

如图1所示为模拟体内微环境的胰腺导管上皮细胞和胰腺腺泡细胞共培养体系模型，共培养体系的构建方法为：胰腺腺泡细胞(1×10⁵个/ml)接种于transwell双层培养室上层，24h后用pbs清洗未贴壁的细胞；用胰酶消化预处理好的人胰腺导管上皮细胞，重新接种到transwell双层培养室下层，每孔加入1ml(人胰腺导管上皮细胞浓度为1×10⁵个/ml)，37℃，5％co2培养箱中培养，24h后用pbs清洗未贴壁的细胞；向transwell双层培养室的上层加入2ml含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素，0.25mg/ml胰蛋白酶抑制剂和25ng/ml重组人表皮生长因子混合物的waymouth培养基，向transwell双层培养室的下层加入1ml含有10％胎牛血清的高糖dmem培养基，插入transwell上层小室，37℃，5％co2培养箱中共培养24h后。给予transwell双层培养室下层的胰腺导管上皮细胞1mmol牛磺胆酸钠刺激，1h后更换新鲜的含有10％胎牛血清的高糖dmem培养基，24h后观察上层胰腺腺泡细胞活力、形态、凋亡等指标。

如图2所示，为在胰腺导管上皮细胞和胰腺腺泡细胞共培养体系模型中，牛磺胆酸钠诱导的胰腺导管上皮细胞损伤对胰腺腺泡细胞活力的影响。其中，对照组：胰腺导管上皮细胞未经任何处理；处理组：胰腺导管上皮细胞经1mm牛磺胆酸钠刺激。与对照组相比，处理组胰腺腺泡细胞的活力显著降低(**p<0.01)。

如图3所示，为在胰腺导管上皮细胞和胰腺腺泡细胞共培养体系模型中，牛磺胆酸钠诱导的胰腺导管上皮细胞损伤对胰腺腺泡细胞形态(腺泡-导管化生)的影响。其中，对照组：胰腺导管上皮细胞未经任何处理；处理组：胰腺导管上皮细胞经1mm牛磺胆酸钠刺激。amylase：淀粉酶(腺泡细胞标志物)；ck19：细胞角蛋白(导管细胞标志物)；hoechst33342：活细胞标记。免疫荧光染色显示，与对照组相比，处理组胰腺腺泡细胞中淀粉酶表达量减少，而ck19表达量增多，提示胰腺导管上皮细胞经1mm牛磺胆酸钠刺激后，与其共培养的胰腺腺泡细胞发生腺泡-导管化生。

图4所示，为在胰腺导管上皮细胞和胰腺腺泡细胞共培养体系模型中，牛磺胆酸钠诱导的胰腺导管上皮细胞损伤对胰腺腺泡细胞凋亡的影响。与对照组相比，处理组中发生晚期凋亡的胰腺腺泡细胞比例升高。

本发明的胰腺腺泡细胞与导管上皮细胞共培养体系的建立方法，以原代培养的腺泡细胞和人胰腺导管上皮细胞系为材料，以transwell双层培养室为骨架建立了两种细胞的共培养体系，两种细胞之间既存在一定的相互联系，又可以相互分离，从而可以对胰腺腺泡细胞与导管上皮细胞在共培养体系的基础上进行相对独立的研究，尤其适用于基于两种细胞相互调控基础上的生理、病理及药理研究，在胰腺疾病相关研究中具有较高的实用价值。

本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。