本发明涉及一种利用青枯菌复杂种性扩繁烟草青枯菌噬菌体的方法，属于生物防控技术领域。
背景技术：
植物青枯病是由ralstoniasolanacearum(简称青枯菌)侵染引起的系统性病害，它是一种典型的维管束病害，最显著的症状是枯萎，发病严重时会造成整株死亡。青枯菌种性复杂，种内具有多个生理小种、生化型、演化型；青枯菌变异多样，不同生理小种在环境中有较强的变异性，侵染不同植物的青枯菌，产生不同的青枯专化型；青枯菌宿主众多，青枯菌能侵染分布在50个科的200多种植物，部分青枯菌生理小种演化成对侵染宿主植物的偏好性或专一性。
目前，在烟叶生产中尽管采用化学药剂防治、合理轮作、种植抗病品种、调整土壤微生物和调整烟苗移栽期等综合措施加以防治，但仍无法有效防控烟草青枯病的发生。噬菌体(bacteriophage，phage)是寄生并侵害细菌的一类噬菌体，又称细菌病毒，在自然界普遍存在，其中烈性噬菌体是细菌的天然“杀手”。噬菌体疗法作为传统药物疗法的替代被寄予厚望，人们期望利用烟草青枯菌，发展安全和有效的防控青枯病的方法和策略。
现有文献公开了一株具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体及其用途(申请号201810386182.9)的专利申请。但在农作物细菌性病害青枯病的防控中，利用侵染青枯菌的噬菌体防控青枯病，一方面人们担心噬菌体扩繁或治疗过程中，因为协同进化出现细菌对噬菌体产生抗性的问题，另一方面也担心扩繁后的噬菌体制剂或产品中携带有未被裂解的青枯菌带来的潜在风险。
技术实现要素：
针对背景技术中提到的技术问题，本发明的目的在于提供一种利用青枯菌复杂种性扩繁烟草青枯菌噬菌体的方法，该方法将青枯菌复杂种性用于烟草青枯菌噬菌体的扩繁，从而降低在扩繁过程中烟草青枯菌对噬菌体产生抗性的风险，也避免了在烟草青枯菌噬菌体菌剂等产品中携带有少量未被裂解烟草青枯菌带来的潜在风险。
本发明的技术方案是：一种利用青枯菌复杂种性扩繁烟草青枯菌噬菌体的方法，包括：
(1)挑选青枯菌噬菌体
选择青枯菌噬菌体，所述青枯菌噬菌体既能够裂解宿主为烟草的青枯菌，又能够裂解宿主为其它作物的青枯菌；
(2)选择扩繁宿主
采用其它作物的青枯菌作为扩繁烟草青枯菌噬菌体的宿主；
(3)利用青枯菌复杂种性扩繁烟草青枯菌噬菌体
将所述青枯菌加入到cpg液体培养基中震荡培养，当吸光值od600为0.2-0.3时，加入所述青枯菌噬菌体菌液震荡培养，离心取上清液过滤得扩繁后的噬菌体溶液备用。
优选地，步骤(2)中其它作物的青枯菌为马铃薯青枯菌、花生青枯菌。
优选地，所述扩繁后的噬菌体溶液浓度为1×107-1×109pfu/ml。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1、利用其它植物宿主的青枯菌繁殖烟草青枯菌噬菌体，可尽量避免协同进化中细菌对噬菌体产生抗性的问题，尽可能降低噬菌体制剂中携带有未被裂解的青枯菌的潜在风险。
2、安全环保，环境友好，侵染青枯菌的噬菌体都是来源于自然土壤环境中。
3、青枯菌噬菌体具有专一性，仅侵染裂解青枯菌，对土壤中的其它菌群无害。
本发明利用青枯菌复杂种性扩繁烟草青枯菌噬菌体的方法，可为烟草青枯病的防控提供噬菌体资源，在烟草青枯病的绿色防控策略及实践具有重要意义。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
1、试验材料
材料：青枯菌株系、青枯菌菌噬菌体株系、cpg培养基、smsa固体培养基、无菌水、移液器、灭菌锅、恒温摇床、超净工作台等。
cpg液体培养基：水解酪蛋白1g，蛋白胨10g，葡萄糖5g，蒸馏水1000ml；ph7.0。
smsa固体培养基：细菌蛋白胨10g，甘油5ml，水解酪蛋白氨基酸/酪蛋白氨基酸1.0g，细菌琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，ph7.0。灭菌后，冷却至50℃时，加入1.0％的多粘菌素2.5ml、1.0％的结晶紫125μl、1.0％的氯化三苯基四氮唑1.25ml、1.0％的杆菌肽625μl、0.1％的青霉素125μl、1.0％的氯霉素125μl。
2、烟草青枯菌噬菌体裂解谱的检测
采用共培养和噬菌斑检测方法，分析青枯菌噬菌体资源对不同生理小种、不同植物病株中分离的青枯菌株系的裂解范围及噬菌斑的形成情况。
青枯菌菌种复苏。蘸取冻存的青枯菌菌液在smsa固体培养基上划线，30℃培育48h。挑取单菌落，一般选取菌落较大，流动性强，中心粉红色，边缘为白色的菌落，作为下步液体培养菌落。
cpg液体培养基培养青枯菌。用接种环挑取上步候选单菌落，在20mlcpg液体培养基中，培养烟草青枯菌，28℃下震荡培养过夜。
烟草青枯菌噬菌体裂解谱的检测。取培养过夜的烟草青枯菌液10.0μl，在20mlcpg液体培养基中继代培养，28℃下震荡培养2-4h；取0μl无菌水，0.5μl、1.0μl、2.0μl和4.0μl噬菌体溶液分别与青枯菌液100μl涂于cpg培养基上，在28℃下共同培养，观察噬菌斑；28℃共培养，观察菌落生长及噬菌体侵噬现象，拍照记录。
3、利用青枯菌复杂种性扩繁烟草青枯菌噬菌体
采用共培养的方法培养获得对烟草青枯菌具有侵染裂解能力的噬菌体株系，在灭菌后的500ml三角瓶中，加入300mlcpg液体培养基和300μl继代培养的青枯菌液，在28℃下震荡培养2-4h，当吸光值od600约为0.2-0.3，加入300μl青枯菌噬菌体菌液(该青枯菌噬菌体既能够裂解宿主为烟草，又能够裂解宿主为其它作物的青枯菌)，在28℃下继续震荡培养2-3h；8000r/min的转速离心培养液10min，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤，获得浓度为1×107-1×109pfu/ml的噬菌体溶液。4-10℃冷藏备用。
实施例1：
利用马铃薯青枯菌rs1.74作为宿主，扩繁烟草青枯菌噬菌体φpb34的方法。
包括以下步骤：
(1)马铃薯青枯菌rs1.74菌种、烟草青枯菌rszp菌种复苏。蘸取冻存的马铃薯青枯菌rs1.74菌种、烟草青枯菌rszp菌种分别在smsa固体培养基上划线，30℃培育48h。
(2)用接种环挑取马铃薯青枯菌rs1.74、烟草青枯菌rszp的单菌落，分别在20mlcpg液体培养基中，培养烟草青枯菌，28℃下震荡培养过夜。
(3)分别取培养过夜的马铃薯青枯菌rs1.74、烟草青枯菌rszp菌液10.0μl，在20mlcpg液体培养基中继代培养，28℃下震荡培养2-4h；取1.0μl无菌水(对照)、1.0μl烟草青枯菌噬菌体φpb34溶液分别与马铃薯青枯菌rs1.74、烟草青枯菌rszp菌液10.0μl混合，加无菌水至2.5ml，混匀后均匀涂于cpg培养基上，在28℃下共同培养。
(3)在灭菌后的500ml三角瓶中，加入300mlcpg液体培养基和300μl继代培养的马铃薯青枯菌rs1.74菌液，在28℃下震荡培养2-4h，当吸光值od600约为0.2-0.3，加入300μl烟草青枯菌噬菌体φpb34菌液，在28℃下继续震荡培养2-3h；8000r/min的转速离心培养液10min，获取取上清液为烟草青枯菌噬菌体φpb34的粗制品；用0.22μm的滤膜过滤，获得浓度为1×107-1×109pfu/ml的噬菌体φpb34溶液。4-10℃冷藏备用。
实施例2：
利用花生青枯菌rs1.70作为宿主，扩繁烟草青枯菌噬菌体φpb2的方法。
包括以下步骤：
(1)花生青枯菌rs1.70菌种、烟草青枯菌rsfxc菌种复苏。蘸取冻存的花生青枯菌rs1.70、烟草青枯菌rsfxc菌种分别在smsa固体培养基上划线，30℃培育48h。
(2)用接种环挑取花生青枯菌rs1.70、烟草青枯菌rsfxc的单菌落，分别在20mlcpg液体培养基中，培养烟草青枯菌，28℃下震荡培养过夜。
(3)分别取培养过夜的花生青枯菌rs1.70、烟草青枯菌rsfxc菌液10.0μl，在20mlcpg液体培养基中继代培养，28℃下震荡培养2-4h；取1.0μl无菌水(对照)、1.0μl烟草青枯菌噬菌体φpb2溶液分别与花生青枯菌rs1.70、烟草青枯菌rsfxc菌液10.0μl混合，加无菌水至2.5ml，混匀后均匀涂于cpg培养基上，在28℃下共同培养。
(3)在灭菌后的500ml三角瓶中，加入300mlcpg液体培养基和300μl继代培养的花生青枯菌rs1.70菌液，在28℃下震荡培养2-4h，当吸光值od600约为0.2-0.3，加入300μl烟草青枯菌噬菌体φpb2菌液，在28℃下继续震荡培养2-3h；8000r/min的转速离心培养液10min，获取取上清液为烟草青枯菌噬菌体φpb2的粗制品；用0.22μm的滤膜过滤，获得浓度为1×107-1×109pfu/ml的噬菌体φpb2溶液。4-10℃冷藏备用。
试验结果与分析：
1、烟草青枯菌噬菌体裂解青枯菌的检测
将实施例1和实施例2中制取的烟草青枯菌噬菌体用于裂解不同类型的青枯菌，结果如表1所示，经检测，实施例1中的烟草青枯菌噬菌体φpb34和实施例2中的烟草青枯菌噬菌体φpb2均可以同时裂解烟草青枯菌、花生青枯菌、马铃薯青枯菌。
表1噬菌体侵染青枯菌株系的检测
注明：表中“+”表示能形成透明的噬菌斑；
2、扩繁烟草青枯菌噬菌体的滴度检测
分别采用烟草青枯菌rszp、rsfxc为宿主，采用噬菌体斑和梯度稀释法，结果显示利用马铃薯青枯菌rs1.74、花生青枯菌rs1.70为宿主，扩繁的烟草青枯菌噬菌体φpb34、φpb2的滴度范围在1×107-1×109pfu/ml之间，经检测，处于该滴度范围的烟草青枯菌噬菌体能够有效的侵染烟草青枯菌。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。