肌球蛋白来源活性肽及其应用的制作方法

本发明属于蛋白活性肽领域，具体涉及肌球蛋白来源的生物活性肽及其应用。

背景技术：

目前，生物活性肽的制备及其应用开发已经成为世界范围内研究的热点。鲜味肽因其可增强食物鲜味和醇厚味，且易于吸收，具有良好的加工特性及营养价值，而受到了越来越多的关注。并且，鲜味肽在食品中的应用也符合“天然、营养、安全”的食品发展趋势。鲜味肽不仅可以增强食物的鲜美口感，还可作为挥发性风味物质的前体物质与美拉德反应，进一步增强食品的特征香味；还能使糖更甜，使盐更咸，降低苦味和酸味，协同五种基本口味，使鲜味更具有质感。鲜味是继酸、甜、苦、咸之后的第五种基本味觉，可以给人带来欢愉感，是人体必不可少的味觉需求。在1908年，日本科学家首次在海带中分离出谷氨酸，并提出鲜味的概念，以umami命名。随后肌苷酸，鸟苷酸等核苷酸也被发现具有鲜味。1978年日本学者从牛肉的蛋白酶解液中分离、提取、纯化出一条美味肽-牛肉八肽(bmp)。随后，逐渐从肉类酶解物、水产品、火腿等食品中也提取出一些具有鲜味的多肽，并将其统一命名为鲜味肽。而鲜味肽是继msg、imp、gmp之后的一种理想的天然鲜味物质。

鲜味肽的制备方法主要有提取法和蛋白降解法，结合凝胶色谱、高效液相色谱等技术对其进行分离纯化得到更高纯度的鲜味肽。但是目前为止，已知食品中的鲜味肽种类有限，其对鲜味的贡献程度也有不同，同时鲜味肽作为一种新型天然鲜味剂也备受人们关注和研究，因此新型鲜味肽亟待开发。

技术实现要素：

本发明目的在于提供：

一种生物活性肽dk，其包括由asp-lys组成的活性肽；

一种生物活性肽eek，其包括由glu-glu-lys组成的活性肽；

一种生物活性肽edqk，其包括由glu-asp-gln-lys组成的活性肽；

一种生物活性肽seggr，其包括由ser-glu-gly-gly-arg组成的活性肽；

一种生物活性肽qdsigs，其包括由gln-asp-ser-ile-gly-ser组成的活性肽。

较优的，所述的活性肽均具有鲜味和浓厚感。可作为基料或辅料来制作调味品，广泛应用于食品加工中。选用味精作为阳性对照，将肽dk、eek、edqk、seggr、qdsigs及味精(msg)配制成0.1mg/ml的溶液。选用aae、ct0、ca0、c00、ae15个测试传感器和2个参比传感器对样品进行检测。结果表明，肽dk、eek、edqk、seggr、qdsigs的鲜味效果均要优于味精(msg)。其中，肽edqk的鲜味强度最高。

较优的，所述的活性肽dk、eek、edqk、seggr、qdsigs均来自虾夷扇贝肌球蛋白，并且分别为肌球蛋白(genbank：bab40711.1)第595～597位、第342～345位、第1383～1387位、第1513～1518位、第1488～1494位的氨基酸残基。

本发明通过toxinpred和peptidepropertycalculator对活性肽dk、eek、edqk、seggr、qdsigs进行毒性、水溶性性质的分析，利用鲜味肽的氨基酸组成、氨基酸的空间排列、分子量等进行多轮筛选，结合分子对接实验，活性肽dk、eek、edqk、seggr、qdsigs与鲜味受体t1r1/t1r3结合紧密。

本发明的生物活性肽dk、eek、edqk、seggr、qdsigs均可以通过基因工程的方法和化学方法人工合成，也可以从肌球蛋白中通过分离纯化、酶降解的方法获得。利用电子舌检测，结果表明肽段dk、eek、edqk、seggr、qdsigs具有鲜味和浓厚感。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明的鲜味肽是小分子量肽，易于被人体吸收。

(2)本发明开发的鲜味肽鲜味强度高，可以代替味精的使用，在食品中的应用意义较大。

(3)本发明获得的鲜味肽纯度高。

附图说明

本发明附图8幅，其中：

图1.62种多肽氨基酸组成图；

图2.鲜味受体t1r1/t1r3模型的ramachandranplot(拉曼图谱)；

图3.鲜味受体t1r1/t1r3的胞外结构模型图；

图4.dk质谱图；

图5.eek质谱图；

图6.edqk质谱图；

图7.seggr质谱图；

图8.qdsigs质谱图。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步阐述。

实施例1虾夷扇贝肌球蛋白的酶解筛选

选用胃蛋白酶(ec3.4.23.1)，胰蛋白酶(ec3.4.21.4)和胰凝乳蛋白酶(ec3.4.21.1)通过expasypeptidecutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)用对肌球蛋白序列(genbank：bab40711.1)进行酶切，获得747条肽序列。

利用toxinpred(http：//crdd.osdd.net/raghava//toxinpred/)对肽的毒性进行分析。通过peptidepropertycalculator(http：//www.innovagen.com/)对肽的水溶性进行分析，筛选获得322条无毒、水溶性良好的活性肽。鲜味肽的呈味与与氨基酸组成、氨基酸的空间排列及肽的分子量有关，含有谷氨酸和天冬氨酸，以及含有一定的亲水性氨基酸，且肽链骨架长度为2-6时，具有较好的呈味效果，且二肽c端为带负电荷的酸性氨基酸，n端为带正电荷的碱性氨基酸，具有呈味特性。基于此，对322条肽进行筛选获得70条符合条件的肽序列。利用活性肽数据库biopep(http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)进行检索和比对，剔除已被报道过的鲜味肽。最终筛选得到62条未被报道的肽序列，结果见图1。

采用modeller9.18构建鲜味受体t1r1/t1r3异源二聚体蛋白模型。选取metabotropicglutamatereceptor(pdbid：1ewk)作为建模模板。在gromacs2018.1软件包中对构建模型进行分子动力学优化。对优化后的鲜味受体模型进行拉氏图计算，结果如图2所示，数据分析表明该模型中有99.3％的氨基酸残基处于允许区内，根据90％的临界评价原则，表明鲜味受体t1r1/t1r3模型构型合理。鲜味受体t1r1/t1r3胞外结构模型如图3所示。

通过discoverystudio(ds)2017客户端软件的cdocker程序进行分子对接。对接能量结果如表1所示，结果表示二肽dk、三肽eek、四肽edqk、五肽seggr和六肽qdsigs具有最低的dockingenergy和dockinginteractionenergy得分，得分越低表示结合越紧密。因此对dk、eek、edqk、seggr和qdsigs进行制备。

表1多肽与鲜味受体t1r1/t1r3的对接能量

实施例2电子舌检测

本实施例选用味精(msg)作为阳性对照。将肽dk、eek、edqk、seggr、qdsigs及msg配制成0.1mg/ml的溶液。选用aae、ct0、ca0、c00、ae15个测试传感器和2个参比传感器对样品进行检测。采用插值法来分析样品的味道，数据处理结果见表2。

表2基于电子舌的不同肽的umami和richness值

结果表明，活性肽dk、eek、edqk、seggr、qdsigs的呈鲜效果均要优于味精(msg)。其中，肽edqk的鲜味强度最高。最终本发明提供了五条鲜味肽。

实施例3活性肽dk、eek、edqk、seggr、qdsigs的化学合成

本实施例采用fmoc法固相合成肽dk、eek、edqk、seggr、qdsigs。在温度为22℃～28℃和常压下，将fmoc-tyr(tbu)-wangresin加入到多肽固相合成反应器中，加入10ml25％哌啶/dmf溶液脱除氨基保护基fmoc，依次同2倍过量的下一个氨基酸的活化羟基反应延长肽链，缩合过程中采用茚三酮定性显色监测反应进程，直至得到合成所需的目标肽段。选择适当的切割条件将目标多肽从树脂裂解下来并除去侧链保护基，溶液经旋蒸后，加入无水乙醚使多肽沉淀析出，经离心、洗涤和真空干燥，即得到目标肽粗品。

采用高效液相色谱对目标肽的纯度进行分析，色谱条件：色谱柱为gemini-nxc18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，进样量20μl；流动相a液为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，流动相b液为0.1％的三氟乙酸水溶液；梯度洗脱方式为2％a+98％b在30min内降为100％a+0％b；流速为1.0ml/min；检测波长为220nm。自动收集洗脱峰。目标肽纯度分别为88％、95％、96％、91％、94％。

采用质谱法对样品进行鉴定。质谱条件为电喷雾电离源(esi)，曲型脱溶剂装置(cdl)温度为250℃，加热块(block)温度为200℃，雾化气流速为1.5l/min，探针(probe)电压为+4.5kv。肽dk、eek、edqk、seggr、qdsigs理论分子量分别为216.27da、404.42da、518.51da、504.49da、605.59da。五个样品的质谱分析报告见图4、图5、图6、图7、图8，得到的分子离子峰分别为261.7、405.2、519.3、505.3、606.3，与肽dk、eek、edqk、seggr、qdsigs理论分子量一致，确定样品为目标肽。

最后，还需注意的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，还可以做出各种变化、修改、替换和变型，其也应视为本发明的保护范围。