hsa-miR-378i作为标志分子在制备诊断结核病试剂盒中的用途及其检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及hsa-mir-378i作为标志分子在制备诊断结核病试剂盒中的用途及其检测试剂盒。

背景技术：

目前，结核病（tb）已成为全球死亡的重要原因，这在很大程度上归因于结核病患者的诊断和治疗困难。早期发现和早期诊断是减少传播机会、控制结核病疫情的关键环节。因此，确定新的生物标志物对结核病及时、准确的诊断，在控制结核病上起着决定性的作用。近年来研究表明，外泌体与结核分枝杆菌感染关系密切，外泌体是由多种活细胞分泌的胞外囊泡小体，大小约为30-100nm，含有多种生物活性成分，参与细胞间的通讯和免疫调节，并参与了炎症反应、细胞凋亡、免疫应答等多种病理生理过程。

微小rna（microrna，mirna）是一类高度保守的非编码rna（non-codingrna），通过与信使rna中特异的互补序列相结合，诱导信使rna降解或抑制蛋白质翻译，调节特定靶蛋白在细胞内的表达。在进行细胞间信息交流时，细胞将mirna浓集在一起，包装进外泌体，由外泌体被释放到细胞间隙。外泌体作为mirna载体，其运载机制复杂，外泌体横向转运细胞成分的能力，赋予它们以抑制或激活靶细胞活动的能力，被认为是细胞间信号传导的重要工具。

外泌体内包裹的mirna与相关蛋白复合物一起到达临近或者远端细胞内，实现了细胞间的信息交流。结核分枝杆菌感染的巨噬细胞所分泌的外泌体含有可溶性分枝杆菌蛋白，这些病原体抗原成分可以诱导特异性免疫应答。结核分枝杆菌感染巨噬细胞后分泌的外泌体可促进巨噬细胞肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ的分泌从而增强巨噬细胞的炎症反应。结核分枝杆菌感染的小鼠巨噬细胞所释放的外泌体与未感染的小鼠巨噬细胞的外泌体相比，其mirna含量存在不同，外来的mirna可以促进巨噬细胞的活化，刺激炎症介质的产生，诱导受体细胞的凋亡。携带rna的外泌体，特别是mirna，在疾病中的诊断中突显潜力。

现有的辅助诊断结核病的mirna是大多来源于血清，但由于血清成分复杂，可能导致mirna来源不明，从而对检测结果产生一定的影响。然而，外泌体mirna因受其表面膜的保护而具有较好的稳定性。与血浆或血清mirna相比，因其成分没有血清复杂，使得外泌体富集的mirna作为生物标志物具有灵敏性高、特异性好等优点。且样本可通过无创方式获得，使得血浆外泌体mirna具备了成为无创、可靠、稳定的生物标志物的优势。现有技术公开了通过血浆外泌体的mirna作为标志分子用于诊断结核病的技术方案，然而其检测灵敏度低，不能实现高灵敏度、高特异性的检测标准。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供hsa-mir-378i作为标志分子在制备诊断结核病试剂盒中的用途及其检测试剂盒，标志分子来源于血浆外泌体，其作为生物标志物具有样本要求低、稳定性好、亲和性好、灵敏性高、特异性好等优点。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

hsa-mir-378i作为标志分子在制备诊断结核病试剂盒中的用途，所述的hsa-mir-378i来源于血浆外泌体，所述的hsa-mir-378i的碱基序列如seqidno:1所示。

一种用于诊断结核病的试剂盒，所述的试剂盒中包含特异性检测hsa-mir-378i的检测试剂；所述的特异性检测hsa-mir-378i的检测试剂包括seqidno:4所示的逆转录引物、seqidno:5和seqidno:6所示的扩增引物以及荧光染料。

hsa-mir-378i联合hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-150-5p中任意一种或者两种作为标志分子在制备结核病诊断试剂盒中的用途，三种标志分子均来源于血浆外泌体，所述的hsa-mir-378i的碱基序列如seqidno:1所示，所述的hsa-mir-148a-3p的碱基序列如seqidno:2所示，所述的hsa-mir-150-5p的碱基序列如seqidno:3所示。

另一种用于诊断结核病的试剂盒，所述的试剂盒中包含特异性检测hsa-mir-378i的检测试剂和特异性检测hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-150-5p中任意一种或者两种的检测试剂；所述的特异性检测hsa-mir-378i的检测试剂包括seqidno:4所示的逆转录引物、seqidno:5和seqidno:6所示的扩增引物以及荧光染料；

所述的特异性检测hsa-mir-148a-3p的检测试剂包括seqidno:7所示的逆转录引物、seqidno:8和seqidno:9所示的扩增引物以及荧光染料；

所述的特异性检测hsa-mir-150-5p的检测试剂包括seqidno:10所示的逆转录引物、seqidno:11和seqidno:12所示的扩增引物以及荧光染料。

进一步的，所述的试剂盒中还包含特异性检测外参基因的检测试剂，所述的外参基因为mirna-39。

有益效果：本发明提供了一种hsa-mir-378i作为标志分子在制备诊断结核病试剂盒中的用途及其检测试剂盒。现有专利采用外泌体中的mir-548o-3p作为结核病的诊断标志物，然而其表达是下调的，其结核组(tb)和健康组(hc)进行roc分析时，auc面积为0.7738。而本申请通过高通量测序筛选出4个差异表达最大的mirna：hsa-mir-378i、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-451a以及hsa-mir-150-5p，再经实时荧光定量pcr验证，其中的hsa-mir-378i、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-150-5p是上调的，且以表达差异最显著的hsa-mir-378i绘制roc曲线，分析血浆外泌体中hsa-mir-378i在结核病中的诊断价值，当结核组(tb)和健康组(hc)进行roc分析时，auc面积为0.932，表明血浆外泌体hsa-mir-378i对结核病的诊断具有较好价值，相比于已有专利公布的数据，具有更高的特异性、灵敏度以及诊断效能。因此，本申请在结核病的诊断领域具有极大的应用前景和市场前景。

附图说明

图1为结核分枝杆菌感染患者与健康对照人群血浆外泌体中四种mirna表达水平的柱状图。

图2为血浆外泌体中hsa-mir-378i的roc曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

用于诊断结核病的标志分子的筛选流程如下：

1、采集受检者血浆：

受检者空腹12h，次日清晨用含有柠檬酸钠抗凝剂的采血管采集肘正中静脉血5ml，静置10min后，常温下以3000r/min离心10min，可见分为两层，用移液枪吸取上层透明淡黄色液体即血浆。

2、应用外泌体提取试剂盒提取血浆中外泌体：

使用life公司的invitrogen外泌体提取试剂盒提取血浆外泌体，按试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

1）、血浆室温下2000×g离心20min去除细胞和碎片。

2）、用移液枪吸取上清液至新的离心管。

3）、室温下10000×g离心20min以除去碎片。

4）、吸取上清液至新的离心管，并将其放置在冰上直至开始分离。

5）、吸取适当体积血浆至新离心管中，加入0.5×血浆体积的1×磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline,pbs）。

6）、涡旋混匀样本。

7）、加入0.2×（血浆体积+1×pbs体积）的外泌体沉淀试剂至样品中。

8）、涡旋混匀血浆/试剂混合物。

9）、在室温下孵育10min。

10）、孵育后，室温下10000×g离心5min。

11）、用移液枪吸出上清液并丢弃，外泌体是试管底部的颗粒。

3、抽提外泌体中总rna：

1）、往外泌体沉淀中加入1mltrizol（takara公司），混匀后于4℃放置10min。

2）、按比例（1mltrizol:200μl氯仿）加入氯仿200μl，剧烈振荡，4℃放置

15min。

3）、4℃12000×g离心15min后吸取上层水相至新ep管。

4）、按比例（1mltrizol:500μl异丙醇）加入异丙醇500ul，混匀，4℃放置

10min。

5）、4℃12000×g离心10min，弃上清，rna沉于管底。

6）、按比例（1mltrizol:1ml75%乙醇）加入75%乙醇1ml，温和振荡。

7）、4℃12000g离心5min，尽量弃上清（重复75%乙醇洗涤一次）。

8）、于室温下晾干。

9）、加10μldepc水溶解rna，吸取2μlrna溶液用于测定浓度，余部分

置于-80℃保存。

10）、将2μlrna溶液在紫外分光光度计中测定rna浓度。

4、应用逆转录、实时荧光定量pcr技术，检测结核血浆外泌体中hsa-mir-378i、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-451a以及hsa-mir-150-5p表达水平：

提取得到的外泌体rna，经硅胶模吸附柱纯化后行逆转录，获得cdna样品，逆转录反应体系（20μl）如下所示：

2×mirnal-rtsolutionmix,10μl；

mirnal-rtenzymemix,1.5μl；

totalrna,3-4µg；

stem-loopprimer(10µm),1μl；

rnase-freewater定容至20μl。

逆转录反应程序如下所示：

16℃，30min；

37℃，30min；

85℃，5min；

4℃，forever。

采用荧光染料参入法（sybrgreen）对外泌体中hsa-mir-378i、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-451a以及hsa-mir-150-5p进行定量检测。采用相对定量法，以mirna-39作为外参基因（加入trizol裂解后迅速加入秀丽线虫mirna-39）应用2^-△△ct方法计算外泌体中hsa-mir-378i、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-451a以及hsa-mir-150-5p表达水平。

荧光定量pcr的反应体系（20μl）如下所示：

2×mirnaqpcrmastermix,10μl；

正向引物prime,5µm1.0μl；

反向引物primer,5µm1.0μl；

templatedna,2μl；

roxreferencedye,1μl；

rnase-free,5μl。

荧光定量pcr反应程序如下所示：

95℃，30s；

95℃，5s；

60℃，30s；

40个循环。

外泌体中每种基因的核酸序列以及对应的逆转录引物和扩增引物的核酸序列如下所示：

1、hsa-mir-378i：acuggacuaggagucagaagg（seqidno:1）；

逆转录引物：

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacccttct（seqidno:4）；

定量pcr引物：

正向引物：gcgcgactggactaggagtc（seqidno:5）；

反向引物：agtgcagggtccgaggtatt（seqidno:6）。

2、hsa-mir-148a-5p：aaaguucugagacacuccgacu（seqidno:2）；

逆转录引物：

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacagtcgg（seqidno:7）；

定量pcr引物：

正向引物：gcgcgaaagttctgagacact（seqidno:8）；

反向引物：agtgcagggtccgaggtatt（seqidno:9）。

3、hsa-mir-150-5p：ucucccaacccuuguaccagug（seqidno:3）；

逆转录引物：

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccactgg（seqidno:10）；

定量pcr引物：

正向引物：gcgtctcccaacccttgta（seqidno:11）；

反向引物：agtgcagggtccgaggtatt（seqidno:12）。

4、hsa-mir-451a：aaaccguuaccauuacugaguu（seqidno:13）；

逆转录引物：

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacaactca（seqidno:14）；

定量pcr引物：

正向引物：cgcgaaaccgttaccattac（seqidno:15）；

反向引物：agtgcagggtccgaggtatt（seqidno:16）。

实施例1

选取65例结核分枝杆菌感染患者和65例健康对照人群，受检者空腹12h，次日清晨用含有柠檬酸钠抗凝剂的采血管采集肘正中静脉血5ml，静置10min后，常温下以3000r/min离心10min，可见分为两层，用移液枪吸取上层透明淡黄色液体即血浆。使用life公司的invitrogen外泌体提取试剂盒提取血浆外泌体。使用trizol抽提外泌体中总rna，逆转录为cdna，使用truseqsmallrnasampleprepkits构建文库，对所得文库进行illuminahiseq高通量测序，使用se50测序策略，去除低质量序列、3’接头、5’污染、ploya片段以及<18nt序列，从而获得高质量小rna序列。统计所得小rna的数量、种类和长度分布，并与mirbase数据库中已知的mirna比对。统计分析结核分枝杆菌感染患者和健康对照人群样本间差异表达的mirna。差异表达最显著的四个mirna分别是hsa-mir-378i、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-451a以及hsa-mir-150-5p，其中hsa-mir-378i、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-150-5p相对于正常人，其上调的表达水平分别为：3.62、2.96、3.07，hsa-mir-451a下调的表达水平为-2.83（见表1）。

表1.高通量测序所示结核分枝杆菌感染患者与健康对照人群血浆外泌体中表达水平差异最显著的四种mirna

应用逆转录、实时荧光定量pcr技术，验证高通量测序中发现的差异表达最为显著的四种mirna，其在结核分枝杆菌感染患者和健康对照人群中差异表达趋势与高通量测序结果相符（见图1，tb：结核分枝杆菌感染患者，hc：健康对照人群）。

以表达差异最显著的hsa-mir-378i绘制roc曲线，分析血浆外泌体中hsa-mir-378i在结核病中的诊断价值，结果表明检测血浆外泌体中hsa-mir-378i的表达水平可作为结核病的诊断标志物。如图2所示，当结核组(tb)和健康组(hc)进行roc分析时，auc面积为0.932，表明血浆外泌体hsa-mir-378i对结核病的诊断具有较好价值，具有特异性好，灵敏度高等特点。

序列表

<110>无锡市第二人民医院

<120>hsa-mir-378i作为标志分子在制备诊断结核病试剂盒中的用途及其检测试剂盒

<141>2019-10-18

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>rna

<213>人的血浆外泌体(humanplasmaexosomes)

<400>1

acuggacuaggagucagaagg21

<210>2

<211>22

<212>rna

<213>人的血浆外泌体(humanplasmaexosomes)

<400>2

aaaguucugagacacuccgacu22

<210>3

<211>22

<212>rna

<213>人的血浆外泌体(humanplasmaexosomes)

<400>3

ucucccaacccuuguaccagug22

<210>4

<211>50

<212>dna

<213>人工序列(化学合成)

<400>4

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacccttct50

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(化学合成)

<400>5

gcgcgactggactaggagtc20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(化学合成)

<400>6

agtgcagggtccgaggtatt20

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<213>人工序列(化学合成)

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<210>8

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<213>人工序列(化学合成)

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gcgcgaaagttctgagacact21

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<213>人工序列(化学合成)

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agtgcagggtccgaggtatt20

<210>10

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<213>人工序列(化学合成)

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<211>19

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<213>人工序列(化学合成)

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<210>12

<211>20

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<213>人工序列(化学合成)

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agtgcagggtccgaggtatt20

<210>13

<211>22

<212>rna

<213>人的血浆外泌体(humanplasmaexosomes)

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aaaccguuaccauuacugaguu22

<210>14

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<213>人工序列(化学合成)

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<213>人工序列(化学合成)

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cgcgaaaccgttaccattac20

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<213>人工序列(化学合成)

<400>16

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