一种用于检测基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法与流程

文档序号:19814005发布日期:2020-01-31 18:49阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于检测基因creb1单核苷酸多态性的pcr-rflp方法,其特征在于:以糖尿病患者和正常人的血液基因组dna为模板,在taqdna聚合酶、缓冲环境、mg++、dntps存在的情况下,利用聚合酶链式反应引物对p进行pcr扩增,然后利用限制性内切酶对其进行酶切,再通过电泳检测即可准确鉴定待测样本的单核苷酸多态性。

2.如权利要求1所述用于检测基因creb1单核苷酸多态性的pcr-rflp方法,其特征在于,所述的聚合酶链式反应引物对p为:

上游引物p-f:5’-cctggagtaccaggaaggacagc-3’23nt

下游引物p-r:5’-ttacacgtatgagccacc-3’18nt

引物p-f中带有下划线的碱基为错配碱基,目的是引入hhai的酶切位点;

pcr扩增后,将产物一分为二,一部分pcr产物用限制性内切酶hhai进行消化,再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳,根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定creb1基因第-1354位的碱基多态性;另一部分pcr产物用限制性内切酶xspi进行消化,再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳,根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定creb1基因第-1343位的碱基多态性。

3.一种权利要求1所述用于检测基因creb1单核苷酸多态性的pcr-rflp方法,其特征在于:所述的pcr扩增条件是:20μl反应体系,包括0.625utaqdna聚合酶,2×buffer10μl(内含mg++、dntps等),0.45μl基因组dna,10pmol/μl上、下游引物各0.5μl和灭菌超纯水8.3μl;

所述的pcr反应程序为:95℃预变性5min;94℃变性30s,54.5℃退火30s,72℃延伸35s,35个循环;72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的用于检测基因creb1单核苷酸多态性的pcr-rflp方法,其特征在于,所述的琼脂糖凝胶的浓度都为3.0%。

5.根据权利要求1所述的用于检测基因creb1单核苷酸多态性的pcr-rflp方法,其特征在于,检测到的人creb1基因启动子区多态性为:基因组第-1354位t>g突变;基因组第-1343位t>a突变。

6.根据权利要求1所述的用于检测基因creb1单核苷酸多态性的pcr-rflp方法,其特征在于,通过电泳判定creb1基因第-1354位的碱基多态性为:tt基因型表现为161bp条带;tg基因型表现为161、139和22bp条带;gg基因型表现为139和22bp条带。

7.根据权利要求1所述的用于检测基因creb1单核苷酸多态性的pcr-rflp方法,其特征在于,通过电泳判定creb1基因第-1343位的碱基多态性为:aa基因型表现为161bp条带;at基因型表现为161、125和36bp条带;tt基因型表现为125和36bp条带。

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