烟酰胺在提高紫色红曲菌产monacolinK上的应用的制作方法

本发明涉及精氨酸在提高紫色红曲菌产monacolink上的应用，属于生物技术制备领域。

背景技术：

红曲菌又称“红曲霉”，在真菌分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，不整子囊菌纲，红曲菌科，红曲霉属。红曲菌可以产生多种次级代谢产物，如红曲色素、monacolink、γ-氨基丁酸和桔霉素等，其中许多代谢产物被广泛的应用于食品色素、医药、酿酒等方面，monacolink又称“洛伐他汀”，是红曲菌产生的一种具有生理活性的聚酮类物质。研究发现，monacolink具有抑制胆固醇合成中关键酶hmg-coa活性的作用，能够有效的抑制胆固醇合成，因此，monacolink被国内外视为降胆固醇的理想药。

红曲菌中monacolink活性成分含量偏低、生产成本高等因素，严重制约了功能性红曲在降脂降压方面作用的发挥，以及功能红曲产品的大规模产业化发展。近年来，为了提高功能红曲的品质，研究人员在优化发酵条件等方面进行了大量深入而细致的研究工作，如rashmidikshit和lijuanyu等人通过响应面法对培养基发酵条件进行优化来提高monacolink产量。陈小林、马义芝和赵树欣等人通过在培养基中添加不同的诱导物来促进monacolink的合成。由于实验菌株、处理方法及检测方法不同，不能很好的确定哪种添加物是最佳诱导物。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种紫色红曲菌产monacolink的发酵培养基，主要是添加精氨酸来刺激诱导monacolink的产量。

本发明基于前期代谢组学研究结果，发现了上千种物质的含量在monacolink合成过程中含量变化幅度较大，通过筛选标准fc>2,p<0.05,vip>1共筛选到800多种，根据superclass分类统计筛选到的差异代谢物的类别约二十余种，从中又筛选出十余种与柠檬酸循环、乙酰-coa合成等相关的物质，初步拟定将十种物质添加到普通发酵培养基中，通过观察第8天和第15天的monacolink产量，从而筛选出对monacolink产量提高最显著的添加物。通过添加不同浓度的上述物质，发现当添加0.5%的烟酰胺时，与原始发酵培养基相比，monacolink产量提高了2.06倍。因此本发明使用0.5%的烟酰胺，与原始培养基同步培养，检测其色价，生物量，monacolink等相关指标。

本发明提供一种紫色红曲菌产monacolink的发酵培养基，成分含有烟酰胺。烟酰胺的含量为0.3-1.5%。

进一步的，烟酰胺的含量为0.5%。

本发明的有益效果是：

本发明将烟酰胺添加到培养基中，当添加量为0.5%时，与原始发酵培养基相比，monacolink产量提高了2.06倍。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1不同发酵时间的颜色比对。

图2原培养基与烟酰胺培养基的生物量。

图3原培养基与烟酰胺培养基的ph值。

图4原培养基与烟酰胺培养基的色素产量。

图5原培养基与烟酰胺培养基的monacolink产量。

图6原培养基与烟酰胺培养基在不同倍率下的的扫描电镜图。a,b为原培养基中菌体形态；c,d为烟酰胺培养基中菌体形态；a、c为放大5000×倍；b、d为放大10000×倍；红箭头为褶皱。

具体实施方式

实施例1烟酰胺对红曲菌monacolink产量影响的实验

实验步骤：

菌株活化:将m1菌株在pda培养基上30℃培养3d，活化2代。

种子液的制备:用接种环从培养基上的菌中刮取1环菌液到普通液体种子培养基中，30℃、200r/min培养2d。

发酵液的制备:按10%的接种量将种子液接种到普通液体发酵培养基中，30℃、150r/min培养2d，然后25℃，150r/min培养12d。

一、发酵液颜色对比

结果见图1。

在发酵的第2天和第5天，添加烟酰胺的培养基较原始培养基颜色较浅，可能其前期对红曲次级代谢产物的合成具有抑制作用。发酵后期两种培养基颜色基本一致，但原始培养基较浓稠。

二、生物量检测

采用干重法测菌丝体生物量。取5ml发酵液用3层纱布过滤，再用蒸馏水洗涤2-3次，拧干水分，在60℃烘箱中烘干至恒重，即为菌丝体干重。

生物量(g/l)=干物质质量/发酵液体积

结果图2显示，原始培养基与添加烟酰胺培养基的生物量变化趋势保持一致，数值也相差不大。

三、ph值检测

首先将ph计校准。先用蒸馏水清洗电极，再用发酵液清洗一次，用玻璃棒搅拌溶液，使溶液均匀，把电极浸入被测溶液中，读出其ph值。每次检测时，用蒸馏水进行冲洗并擦干。

结果见图3，两种培养基的ph值差异不大，在第2,5,8天，烟酰胺培养基的ph值低于原培养基。在发酵的第12和15天，烟酰胺培养基的ph值高于原培养基。

四、色价检测

发酵液的预处理：取发酵液1ml，加入8ml70%的乙醇溶液，于恒温水浴锅60℃浸提1h，4000rpm离心15min，避光放置。

色价的检测：用紫外分光光度计测定410、448、505nm处吸光值。

定量公式：红曲色素色价（u/ml）=吸光值×稀释倍数

结果如图4，烟酰胺培养基的三种红曲色素产量均低于原培养基。

五、monacolink检测

发酵液的预处理：取发酵液5ml，加入15ml75%的甲醇，超声波萃取30min，静置过夜。

monacolink的检测：采用hplc法，色谱柱：inertsilods-3c18(150mm×4.6mm×5µm)，流动相：0.1%磷酸：甲醇=1：3，流速1ml/min，检测器为紫外检测器(pda)，检测波长237nm，检测温度30℃，进样量10μl。

图5所示，发酵前期，烟酰胺对于monacolink的产生具有抑制作用，而在发酵的第15天，烟酰胺培养基的monacolink产量高于原培养基，说明发酵后期为促进作用。

六、扫描电镜处理

培养8d的红曲菌菌体，12000r/min离心5min收集菌体细胞，将细胞重悬（用枪头吹打，吹打时注意不要将细胞吸入枪头造成细胞损失）于2.5%戊二醛溶液（pbs缓冲溶液稀释）固定12h。用0.1m磷酸盐缓冲液（pbs，ph7.2）漂洗细胞两次（两次重悬离心）弃去上清液。依次用不同浓度的乙醇溶液（30%，50%，70%，80%，90%，100%）对细胞进行脱水，每种浓度静置10min，12000r/min离心5min（每种浓度重复两次），弃去上清液。先把菌体重悬于醋酸异戊酯与乙醇（v：v=1:1）中，再重悬与醋酸异戊酯溶液中，以对细胞进行乙醇置换。将细胞重悬于每种溶剂中静置10min，12000r/min离心5min，弃去上清液。加入溶剂六甲基二硅胺(hexamethyldisilazane，hmds)，用量没过样品即可，用脱脂棉将离心管口塞上，置于60˚c烘箱干燥直至样品成粉末状，留待观察。

图6所示，原培养基的菌丝体表面褶皱较多，而孢子头则比较饱满。烟酰胺培养基则相反，菌丝体表面具有较少的褶皱，而孢子头有明显的凹陷。