一种痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法与流程

本发明属于微生物技术领域，具体为一种痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法。

背景技术：

痤疮丙酸杆菌是一种厌氧的革兰阳性杆菌，主要定植在皮肤毛囊皮脂腺单位，是人体皮肤的共生菌群。细菌生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生存方式，有三个关键的组成部分：细菌细胞、供细菌附着的平面，以及细胞外的多糖蛋白复合物。后者由细菌分泌，并能够保护细菌免受宿主免疫反应及局部和系统抗生素治疗的伤害。由于痤疮丙酸杆菌生长缓慢，临床怀疑是痤疮丙酸杆菌引起的严重或深部感染，需延长厌氧培养至14天，且生长所需环境条件严格（微需氧或厌氧），故体外构建其生物膜的难度较大，按照常规生物膜构建方案难以很好地形成生物膜。再加上目前还未有针对痤疮丙酸杆菌特性进行独特设计的培养基，使得痤疮丙酸杆菌的体外培养变得尤为困难。

技术实现要素：

本发明的目的在于：为了解决采用现有技术对体外构建痤疮丙酸杆菌生物膜不够理想的问题，提供一种痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法，具体步骤如下：

步骤1：准备原料，称取35-40g的bhi（厌氧脑心浸液）干粉，3-7g的酵母提取物；

步骤2：配置培养基，将35-40gbhi干粉、3-7g酵母提取物溶于0.8-1.2l水中，再加入葡萄糖配制成1%葡萄糖溶液，混合搅拌均匀，制得培养基，记为bhisup.培养基（bhisupplemented培养基），调整培养基ph值为7.0；

步骤3：复苏种菌，将冻存的痤疮丙酸杆菌菌株于室温下融化，然后在血平板上划线种菌，待细菌复苏后接种于布氏琼脂肉汤，菌株的od600nm均调整为0.08-0.12，使用振荡培养箱在振荡转速200-300rpm环境下35-38℃厌氧培养110-140h；

步骤4：重悬菌体，使用无菌离心管收集培养出的菌体，采用离心机处理，离心转速4000-6000rpm，时间5-8mi，吸弃上层清液不用，然后使用布氏琼脂肉汤重悬菌体，调整od600nm值至0.9-1.1；

步骤5：菌种培养，将重悬后的菌体以1:100-1:200比例使用bhisup.培养基进行稀释，然后加入96孔板（200ul／孔），37℃厌氧培养120h。这一时间只需要5天，远远小于通用方法中的14天。

其中，所述冻存的痤疮丙酸杆菌的菌种取自痤疮患者皮损处，经分离鉴定后获得，保证痤疮丙酸杆菌的纯净。

其中，所述取得的菌种放置在甘油中，于-80℃中保存。

其中，步骤1中所述酵母提取物使用高纯度高蛋白型酵母提取物。

其中，步骤2中所述水为去离子水。

本发明的有益效果是：

1、通过配置的bhisup.培养基，并在厌氧环境下进行痤疮丙酸杆菌培养，解决了由于痤疮丙酸杆菌生长条件严苛（厌氧或微需氧），且生长速率慢，现有技术中在体外构建其生物膜较为困难的问题；

2、bhisup.培养基价格低廉、容易配制，用其构建的痤疮丙酸杆菌生物膜生物量、生物膜内活菌数量、生物膜结构均优于现有常规培养基（培养至第96及120h，结晶紫染色测量od570nm发现bhisup.培养基培养下痤疮丙酸杆菌生物膜生物量明显高于bhi、tsb培养基（p<0.05）；培养至第96及120h，刃天青染色测量560em/590ex荧光发现bhisup.培养基培养下痤疮丙酸杆菌生物膜内活菌数量明显高于bhi、tsb、tsbsup.培养基（p<0.05）；培养至第120h，激光共聚焦显微镜观察发现bhisup.培养下痤疮丙酸杆菌形成的生物膜较tsbsup.培养下痤疮丙酸杆菌形成的生物膜附着性更强，其内痤疮丙酸杆菌排列更为有序），是研究痤疮丙酸杆菌生物膜的理想培养基，为后续研究痤疮丙酸杆菌生物膜及其在抗生素耐药中的作用奠定了基础。

附图说明

图1为使用待测培养基培养痤疮丙酸杆菌至第96小时所形成的生物膜生物量。其中，a为培养至第96h时，使用bhisup.培养基能明显增加痤疮丙酸杆菌生物膜的生物量，b为培养至第96h时，使用tsbsup.培养基能明显增加痤疮丙酸杆菌生物膜的生物量。

图2为使用待测培养基培养痤疮丙酸杆菌至第120小时所形成的生物膜生物量。其中，a为培养至第120h时，使用bhisup.培养基能明显增加痤疮丙酸杆菌生物膜的生物量，b为培养至第120h时，使用tsbsup.培养基能明显增加痤疮丙酸杆菌生物膜的生物量。

图3为为培养至第96h时，使用添加葡萄糖和酵母提取物的培养基（bhisup.，tsbsup.）能明显增加痤疮丙酸杆菌生物膜内活菌数量。且bhisup.培养下所形成的痤疮丙酸杆菌生物膜内活菌数量较tsbsup.更多。

图4为为培养至第120h时，使用添加葡萄糖和酵母提取物的培养基（bhisup.，tsbsup.）能明显增加痤疮丙酸杆菌生物膜内活菌数量。且bhisup.培养下所形成的痤疮丙酸杆菌生物膜内活菌数量较tsbsup.更多。

图5为使用bhisup.与tsbsup.分别培养痤疮丙酸杆菌至第120小时生物膜形态（截取荧光最强的平面）。其中，a为使用bhisup.，b为使用tsbsup.。

图6为使用bhisup.与tsbsup.分别培养痤疮丙酸杆菌至第120小时生物膜形态（所有平面荧光叠加）。其中，a为使用bhisup.，b为使用tsbsup.。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：一种实验研究用痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法，包括以下步骤；

步骤1：准备原料，称得37g的bhi干粉、5g的酵母提取物、10g葡萄糖和1l的去离子水；

步骤2：配置培养基，将37g的bhi干粉与去离子水混合，同时加入5g酵母提取物、10g葡萄糖，混合搅拌均匀，制得bhisup.培养基，培养基ph值为7.0；

步骤3：复苏种菌，将冻存的痤疮丙酸杆菌菌株于室温下融化后在哥伦比亚血琼脂平板上划线种菌，待细菌复苏后接种于布氏琼脂肉汤，菌株的od600nm均调整为0.1，使用振荡培养箱在温度37℃，转速220rpm环境下振荡厌氧培养120h；

步骤4：重悬菌体，使用无菌离心管收集培养出的菌体，采用离心机处理，离心转速6000rpm，时间5min，抽离上层清液不用，然后使用布氏琼脂肉汤重悬菌体，调整od600nm值至1.0；

步骤5：菌种培养，将重悬后的菌体以1:100比例使用bhisup.培养基进行稀释，然后加入96孔细胞培养板（200ul／孔），在37℃厌氧环境下培养120h。

实施例2：bhisup.培养基有益效果的对比实验

1.实验

1.1材料

本实验所用的痤疮丙酸杆菌菌株均取自复旦大学附属华山医院痤疮患者，共44株。各种培养基、葡萄糖、酵母提取物均购自英国oxoid公司。live/dead染液购自美国invitrogen公司。celltiter-blue染液购自美国promega公司。96孔细胞培养板（3599）和96孔酶标板购自美国corning公司。fluorodish（fd35-100）购自美国wpi公司。紫外分光光度计购自德国eppendorf公司。酶标仪购自德国biometragmbh公司。激光共聚焦显微镜购自德国leica公司。

培养基配制

（1）bhi培养基：称量37gbhi干粉溶于1l去离子水中；

（2）tsb培养基：称量30gbhi干粉溶于1l去离子水中；

（3）bhisup.（bhisupplemented）培养基：称量37gbhi干粉、5g酵母提取物溶于1l去离子水中，再加入葡萄糖配制成1%葡萄糖溶液；

（4）tsbsup.（tsbsupplemented）培养基：称量30gbhi干粉、5g酵母提取物溶于1l去离子水中，再加入葡萄糖配制成1%葡萄糖溶液。调整所有培养基的ph值为7。

细菌的培养

将冻存的痤疮丙酸杆菌菌株于室温下融化后在哥伦比亚血琼脂平板上划线种菌。复苏后接种于布氏琼脂肉汤，调整所有菌株的od600均相同，且都小于0.1，37℃220rpm振荡厌氧培养120h。用无菌离心管收集菌体，6000rpm，5min，弃上清。用布氏琼脂肉汤重悬菌体，调整至od600=1.0，再用待测培养基分别以1:100稀释，加入96孔细胞培养板（200ul／孔），37℃厌氧培养120h。当培养至第96h，120h时，分别进行以下操作：弃菌液。加入pbs（200ul／孔）洗去未粘附细菌，重复洗3次。

痤疮丙酸杆菌生物膜半定量检测

向已使用pbs洗去未粘附细菌的96孔板加入99%甲醇固定15min，弃去液体后室温干燥。再加入1%结晶紫染色8min，自来水冲洗至流水无色，室温干燥。10%乙酸溶液溶解生物膜，室温干燥后测定od570。每个菌株在每种培养基培养下至少重复3次。

痤疮丙酸杆菌生物膜内活菌数量检测

已使用pbs洗去未粘附细菌的96孔板在室温下干燥。每孔加入100ul生理盐水，反复吹打使生物膜内细菌完全重悬于生理盐水中。将每孔内重悬后的菌液分别转移至白色96孔酶标板内，并向每孔加入20ulcelltiter-blue试剂，300rpm摇1min，37℃厌氧培养1h。酶标仪记录荧光。celltiter-blue试剂，即溶解于缓冲溶液中的高纯度的刃天青。细胞可将深蓝色的氧化型染料(刃天青)转化为红色的还原型染料(试卤灵)。因为无活性的细胞很快丧失了代谢能力而不能还原刃天青，也就不能产生荧光信号，所以，该染液可特异性检测活性细胞。

痤疮丙酸杆菌生物膜结构的观察

选取复苏后的痤疮丙酸杆菌离心后，用bhisup.和tsbsup.培养基分别重悬菌体，调整至od600=1.0，再用两种培养基分别以1:10稀释，加入fluorodish（2ml／dish），37℃厌氧培养至120h。弃上清，生理盐水轻柔洗3次，加入600ullive/dead染液，室温放置20min后于激光共聚焦显微镜下观察。每个dish至少选择5处进行观察（4个角落和中央）。实验至少重复3次。

数据分析

采用spss22.0软件进行数据分析，单因素方差分析比较不同培养基的od570nm、560em/590ex荧光值之间的差异。p<0.05为有显著差异。采用graphpadprism6软件绘图，结果用mean±sd表示。

2.结果

2.1痤疮丙酸杆菌生物膜半定量检测

培养至第96h时，结晶紫染色发现使用添加葡萄糖和酵母提取物的培养基能明显增加痤疮丙酸杆菌生物膜的生物量（p<0.05）。（bhi培养基od570nm=1.211±0.893，bhisup.培养基od570nm=2.299±1.158，tsb培养基od570nm=1.152±0.809，tsbsup.培养基od570nm=2.418±1.067）（图1（a）、图1（b））。培养至第120h时，亦得到同样结果。（bhi培养基od570nm=1.789±0.928，bhisup.培养基od570nm=3.202±0.392，tsb培养基od570nm=1.462±1.087，tsbsup.培养基od570nm=3.092±0.376）（图2（a）、图2（b））。但培养至96和120h时，使用bhisup.培养基和tsbsup.培养基两者所形成的痤疮丙酸杆菌生物膜生物量均无显著差异。图1使用待测培养基培养痤疮丙酸杆菌至第96小时所形成的生物膜生物量。图2使用待测培养基培养痤疮丙酸杆菌至第120小时所形成的生物膜生物量。

痤疮丙酸杆菌生物膜内活菌数量检测

培养至第96h时，刃天青染色发现使用添加葡萄糖和酵母提取物的培养基（bhisup.，tsbsup.）能明显增加痤疮丙酸杆菌生物膜内活菌数量（p<0.05）。且bhisup.培养下所形成的痤疮丙酸杆菌生物膜内活菌数量较tsbsup.更多（p<0.05）（bhi培养基560em/590ex=1931.189±1165.627，bhisup.培养基560em/590ex=3645.436±1207.309，tsb培养基560em/590ex=1633.863±853.361，tsbsup.培养基560em/590ex=2629.740±972.400）（图3）。培养至第120h时，亦得到同样结果。（bhi培养基560em/590ex=1835.294±941.173，bhisup.培养基560em/590ex=2923.336±1101.452，tsb培养基560em/590ex=1395.946±936.702，tsbsup.培养基560em/590ex=2046.022±907.410）（图4）。

痤疮丙酸杆菌生物膜形态的观察

通过以上两步实验，初步确定了添加葡萄糖和酵母提取物的培养基是适宜体外培养痤疮丙酸杆菌并体外构建其生物膜的培养基。为进一步比较bhisup.和tsbsup.，使用这2种培养基分别培养痤疮丙酸杆菌120h后，通过激光共聚焦显微镜观察生物膜形态。选取荧光最强的平面（图5（a）、5（b））和所有平面荧光叠加后的结果（图6（a）、6（b））进行观察，发现bhisup.培养下痤疮丙酸杆菌形成的形成的生物膜能够牢固的附着于fluorodish底部，经pbs水洗后仍未与fluorodish底部脱离。在激光共聚焦显微镜下可看到fluorodish底部均匀附着一层膜状结构，其内痤疮丙酸杆菌较为整齐地排列成链条状。而tsbsup.培养下痤疮丙酸杆菌形成的生物膜附着不牢固，经pbs水洗后大部分与fluorodish底部脱离，分散成块状漂浮。在激光共聚焦显微镜下生物膜内部结构无法被清晰观察。图5使用bhisup.与tsbsup.分别培养痤疮丙酸杆菌至第120小时生物膜形态（截取荧光最强的平面）图6使用bhisup.与tsbsup.分别培养痤疮丙酸杆菌至第120小时生物膜形态（所有平面荧光叠加）。

本研究测试了4种不同的培养基，通过结晶紫染色检测生物膜生物量，刃天青染色检测生物膜内活菌数量，激光共聚焦显微镜观察生物膜结构，来评价这些培养基是否适合体外培养痤疮丙酸杆菌并构建其生物膜。当培养至第96h时，bhisup.、tsbsup.培养下所形成的痤疮丙酸杆菌生物膜的生物量（od570nm）明显高于单纯bhi、tsb培养基，而bhisup.培养下的痤疮丙酸杆菌所形成的生物膜内的活菌数量是4种培养基中最高的。当培养至第120h时，亦得到了同样的结果。通过结晶紫刃天青染色，初步确定了bhisup.是4种培养基中最适宜体外培养痤疮丙酸杆菌并构建其生物膜的培养基。为进一步证实以上结论，分别对bhisup.和tsbsup.培养下所形成的痤疮丙酸杆菌生物膜进行激光共聚焦显微镜观察。可以看到，bhisup.培养下痤疮丙酸杆菌形成的生物膜经过3次pbs水洗仍然能够牢固附着于fluorodish底部，呈均匀的膜状结构，其内部排列更有序。而tsbsup.培养下痤疮丙酸杆菌形成的生物膜附着不牢固，经过3次pbs水洗后大部分与fluorodish底部脱离，且生物膜内部结构无法被清晰观察。从生物膜结构及对平面的附着能力看，bhisup.较tsbsup.更适宜用于体外构建痤疮丙酸杆菌生物膜。酵母提取物和海带水提液具有很好的促进大肠杆菌生长的作用其原因是海带水提液含有多种无机盐、有机酸、维生素、微量元素、氨基酸和糖类；酵母提取物中含有丰富的氨基酸、肽类、水溶性维生素。添加葡萄糖、酵母提取物、维生素k的培养基能促进大肠杆菌生长及生物膜形成。添加酵母提取物和葡萄糖的培养基可以促进痤疮丙酸杆菌生长及其生物膜形成，添加以上两种成分相当于为细菌增加了了丰富的生长所需的碳源和氮源。综上所述，bhisup.价格低廉、容易配制，用其构建的痤疮丙酸杆菌生物膜生物量、生物膜内活菌数量、生物膜结构均较优于其余培养基，是研究痤疮丙酸杆菌生物膜的理想培养基。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。