用于构建肿瘤pH响应微型机器人的人源性多肽及其应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于构建肿瘤ph响应微型机器人的人源性多肽及其应用。

背景技术：

据世界卫生组织最新统计，2018年估计有960万人死于癌症。肿瘤的早期诊断和治疗是降低癌症死亡率的最有效方法。纳米技术因其独特的特性，在癌症的早期诊断和治疗中得到广泛的关注；并且一些纳米医学材料已被批准用于临床癌症治疗。然而，由于纳米技术在临床试验中的疗效并不十分理想，许多有希望应用于癌症患者的纳米技术尚未进入临床。联合治疗，如化疗/免疫治疗、化疗/光热治疗、化疗/光动力治疗、光动力/光热治疗，均显示出明显的抗肿瘤作用。此外，许多的显像剂，包括荧光、mri、ct和超声波图像，也被链接到纳米载体上用于癌症早期检测诊断。因此，将多模态治疗和诊断组合在一个智能纳米和微小机器人上，通过提高肿瘤的抗肿瘤效果和早期诊断准确性，是一种很有前途的临床应用策略。

自组装肽纳米材料的设计和构建可通过非共价相互作用，如离子、疏水性、氢键和π-π堆积相互作用，呈现出明确的纳米结构；同时由于其结构的优点，功能多样性，高生物相容性和生物降解性，使其生物医学领域有着广泛的运气前景。此外，一些外环境刺激可以改变自组装肽的功能和结构，例如ph、温度、光和酶，成为生物传感器、组织工程、药物传递和智能生物材料的最佳候选者。

实体瘤的快速生长需要消耗大量的营养和氧气，因此选择性地阻断肿瘤血管可能会引发肿瘤细胞的大量死亡，称为肿瘤饥饿治疗。抗血管生成疗法是一种主要的癌症饥饿疗法，通过抑制肿瘤中的血管生长来阻断营养物质和氧气的供应。然而，它仍然是一个巨大的挑战，例如，开发新的抗血管生成药物，严重的脱靶效应，癌细胞的平行能量供应和任何毒性和副作用。直接阻断肿瘤血管有可能使癌细胞饿死，也可避免脱靶效应。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明针对上述技术问题，提供一种用于构建肿瘤ph响应微型机器人的人源性多肽及其应用。该微型机器人通过自组装的人源性肽纳米颗粒来装载吡柔比星和吲哚菁绿，联合化疗、光热治疗和饥饿治疗于一体以及肿瘤的实时诊断相结合。微机器人在肿瘤酸性ph的微环境下触发，释放吡柔比星和不溶性沉积物（p60和吲哚箐绿的结合物），并逆转它们的荧光发射强度。释放的吡柔比星选择性地进入肿瘤细胞核并杀死它们，而不溶性沉积物可以在肿瘤血毛细血管中积累，阻断氧气和营养供应，实现癌症饥饿治疗。在近红外激光照射下，肿瘤中有效积累的吲哚菁绿可诱导局部热疗。微机器人荧光发射强度的ph响应反向逆转可用于体内肿瘤的实时诊断。

技术方案：用于构建肿瘤ph响应微型机器人的人源性多肽，氨基酸序列如seqidno.1所示。

上述人源性多肽在制备用于肿瘤ph响应的微型机器人的应用。

肿瘤ph响应微型机器人的制备方法为：先将等质量粉状的人源性多肽和吲哚菁绿均匀混合后，加水触发两者自组装；然后加入抗肿瘤药物在超声作用下激发形成肿瘤ph响应的微型机器人。

优选的，上述加水量的质量为粉末质量的2-3倍。

优选的，上述抗肿瘤药物为吡柔比星。

优选的，上述超声功率为40-60w时间为20分钟。

有益效果：1.人源肽天然有高生物相容性、无毒、无免疫源性；2.通过多肽的自组装构建由球形纳米颗粒组成的微型机器人，其具有高效负载药物能力和敏感的肿瘤酸性ph微环境响应释放，可提高药物靶向作用，更好的降低药物副作用；3.释放的吡柔比星高效率地递送至肿瘤细胞核实现靶向化疗；释放的吲哚菁绿聚集于肿瘤组织和细胞内，并在红外激光的照射下实现光热治疗；释放的不溶物可选择性阻塞肿瘤血管，切断肿瘤的营养物质和氧气的供给，实现肿瘤饥饿治疗；4.微型机器人在酸性ph微环境的肿瘤内，其荧光发射强度发生翻转，实现肿瘤体内荧光诊断。

附图说明

图1为微型机器人的电镜图，可以清晰见约为50nm球形纳米颗粒组成大小为300-900nm的微型机器人。

图2为动态光散射粒径分析仪（dls）分析微型机器人的粒径大小图，同电镜结果基本相似。

图3激光共聚焦显微镜分析微型机器人的成份，红色为吡柔比星，绿色为吲哚菁绿，黄色为二者合并后的颜色，说明吡柔比星和吲哚菁绿组合成功。

图4肿瘤酸性ph响应的微型机器人，通过肉眼直观和荧光分光光度计分析ph响应。

图5微型机器人的光热效应，即使在酸性环境下同样具有光热效应。

图6微型机器人体外的化疗和光热联合治疗的结果。

图7微型纳米机器人的肿瘤饥饿治疗的示意图，激光共聚焦显微镜结果显示肿瘤血管被阻塞。

图8微型纳米机器人体内实时荧光诊断。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

1）设计和合成人源肽的序列如下：

glu-ser-leu-val-lys-phe-gln-ala-lys-val-glu-gly-leu-leu-gln-ala-leu-thr-arg-lys-leu-glu-ala-val-ser-lys-arg-leu-ala-ile-leu-glu-asn-thr-val-val-gly-lys-ile-arg-ser-leu-his-thr-asp-ala-leu-lys-lys-leu-ala-val-lys-cys-glu-asp-leu-phe-met-ala

2）微型机器人的合成方法

首先称取等质量的粉末状的人源肽和吲哚菁绿并两者均匀混合，加入微量水激发吡柔比星和吲哚菁绿自组装，离心收集组装成功的复合物；第二，加入与吲哚菁绿等质量的吡柔比星，并在超声作用下即可合成微型机器人。

3）微型机器人的表征

通过tem（图1），动态光散射粒度仪（图2），共聚焦显微镜（图3），荧光光谱仪（图4），光热成像（图5）等技术验证微型机器人的外貌和成份。

4）微型机器人实现化疗、光热治疗和肿瘤饥饿治疗联合治疗

将微型机器人与肿瘤细胞共同孵育，体外验证微型机器人的肿瘤酸性ph响应下的化疗以及光热治疗（图6）。建立mda-mb-231荷瘤裸鼠模型，将微型机器人通过尾静脉注射小鼠体内，体内验证微型机器人的体内化疗、光热治疗以及瘤饥饿治疗的效果（图7）。

5）微型机器人实现体内肿瘤的实时荧光诊断

mda-mb-231荷瘤裸鼠模型建立后，微型机器人原位注入肿瘤部位，体内验证微型机器人的体肿瘤的实时荧光诊断（图8）。

实施例1：人源性多肽通过自组装功能装载同时装载吡柔比星和吲哚菁绿形成微型机器人，并对微型机器人进行表征：

合成方法：首先将1mg多肽冻干粉和1mg粉状的吲哚菁绿在涡旋振荡器下充分混合，快速离心收集绿色混合物。第二，5μl水缓慢添加到绿色混合物中并不断搅拌。充分混匀后，加入1ml水溶解未结合的多肽和吲哚菁绿，5000rpm离心10分钟收集不溶物。最后，不溶物中加入1mg吡柔比星和1ml水，震荡混匀后放置冰浴中超声20分钟。

表征：运用透射电镜，动态光散射粒径分析仪（dls）研究药物投递系统形态外貌及粒径大小，发现其为50nm左右的球形纳米颗粒组成大小为300-900nm的微型机器人。参见图1,2。

实施例2：微型机器人的肿瘤酸性ph响应

释放环境验证：酸性ph是肿瘤组织的主要特征，因此肿瘤酸性ph常被设计为药物控制释放的靶向触发器。荧光光谱检测微型机器人发射强度光谱的变化在ph=7.4和ph=6.5的环境中。参见图4，随着ph至6.5，我们发现含微型机器人的溶液变浑浊，出现绿色沉淀；用荧光光谱检测溶液的荧光发射强度发现其荧光强度的出现反转，吲哚箐绿的荧光强度降低数百倍，吡柔比星的荧光强度增加数十倍，此结果说明吡柔比星在酸性下释放，吲哚箐绿团聚引起荧光淬灭。

实施例3：微型机器人酸性ph环境下抗肿瘤生长

运用cck-8检测微型机器人在ph=7.4和ph=6.5的环境中对乳腺癌细胞mda-231的杀伤作用。1×10⁵个细胞接种于96孔板中，过夜生长后，孵化不同浓度的吡柔比星和微型机器2小时，分别在ph=7.4和ph=6.5的培养基。2小时后，换上新鲜的培养基再继续培养24小时，cck-8检测肿瘤细胞的活力。参见图6：h、i，我们发现微机器人和游离吲哚箐绿对癌细胞的生长没有抑制作用，说明它们具有很强的生物相容性；但是随着游离吡柔比星的增加，越来越多的癌细胞被杀死。当h+触发微型机器人释放吡柔比星,微型机器人的细胞毒性效应显著增强,超过游离吡柔比星。结果表明，基于酸性ph触发释放的药物传递系统在靶向治疗中发挥了重要作用。

实施例4：微型机器人酸性ph环境和红外激光照射下共同抗肿瘤生长

运用cck-8检测微型机器人在ph=6.5的环境中和红外激光照射下对乳腺癌细胞mda-231的杀伤作用。1×10⁵个细胞接种于96孔板中，过夜生长后，孵化不同浓度的吡柔比星和微型机器人2小时在ph=6.5的培养基中。2小时后，用红外激光器照射5分钟后换上新鲜的培养基并，再继续培养24小时后cck-8检测肿瘤细胞的活力。参见图6：j,为了研究癌症细胞的光热治疗效果，在h+触发后，游离吲哚箐绿、游离吡柔比星和微机器人与细胞共孵育后进行近红外照射5分钟。结果显示微机器人化疗光热联合治疗的细胞存活率明显低于单纯化疗或光热治疗。

实施例5：微型机器人体内实现肿瘤饥饿治疗，通过选择性阻塞肿瘤毛细血管

6周龄雌性裸鼠皮下接种约1×10⁷个mda-mb-231细胞，建立异种移植模型。当肿瘤直径达到1cm左右时，尾静脉注射浓度为20mg/kg的吡柔比星微型机器人。24h后处死小鼠，收集器官及肿瘤组织制作成冷冻切片，进行免疫荧光分析。用dapi标记细胞核，fitc-cd31标记血管内皮细胞。采用共聚焦激光扫描显微镜，分别在405nm、488nm、561nm和633nm处激发dapi、fitc、吡柔比星和吲哚菁绿形成。参见图7,首先，吲哚箐绿和吡柔比星在肿瘤组织中的发射强度明显强于内脏器官，这意味着微机器人对靶向药物的传递具有良好的效果。其次，也是最重要的，我们发现一条红色的发射强度带（红色箭头），只充满了肿瘤血管，而绿色的荧光消失了。此外，吡柔比星在阻塞血管周围的发射强度将显著增强，这可能意味着吡柔比星在肿瘤中更有效地积累。这表明我们的微机器人有能力选择性地阻断肿瘤血管，因其在酸性激活可释放的不溶性物质。

实施例6：微型机器人体内肿瘤实时荧光诊断

6周龄雌性裸鼠皮下接种约1×107个mda-mb-231细胞，建立异种移植模型。当肿瘤直径达到1cm左右时，肿瘤和肝脏原位注射微型机器人，半个小时后用小动物体外成像仪采集荧光信号。参见图8，在肝脏中吡柔比星的荧光信号很柔。但吲哚箐绿信号清晰可见，说明吡柔比星在中性ph肝脏中没有释放。吡柔比星和吲哚箐绿信号在肿瘤部位及周围均可见，且其最强发射强度的位置无重叠。显然，吡柔比星在到达肿瘤酸性微环境后会从微机器人体内释放出来。

序列表

<110>东南大学

<120>用于构建肿瘤ph响应微型机器人的人源性多肽及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>60

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gluserleuvallyspheglnalalysvalgluglyleuleuglnala

151015

leuthrarglysleuglualavalserlysargleualaileleuglu

202530

asnthrvalvalglylysileargserleuhisthraspalaleulys

354045

lysleualavallyscysgluaspleuphemetala

505560