FaLBD39在增加草莓果实中花青苷积累中的应用及增加草莓果实中花青苷积累的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种falbd39在增加草莓果实中花青苷积累中的应用及增加草莓果实中花青苷积累的方法。

背景技术：

草莓是世界七大水果之一，不仅色泽靓丽，清香可口，而且富含花青苷等多酚类物质。花青苷，是一种天然的植物色素。它不仅可以赋予植物丰富多彩的色泽，对植株的生长发育及果实品质也有着重要的作用：花青苷的积累可以提高植株的抗病、抗氧化和抗紫外线能力；花青苷也是评价果实成熟度和果实品质的一个重要指标。花青苷具有丰富营养价值和药用价值，它的抗氧化性使其成为一种天然的强效自由基清除剂，具有抗氧化、抗突变、预防心脑血管疾病、保护肝脏和抑制肿瘤细胞发生等多种保健功能。因此，在心血管疾病和癌症频发的现代社会，富含花青素的草莓备受人们的青睐。

lbd是高等植物所特有的一类转录因子，该家族成员通常在n端包含一个保守的lob结构域，推测其具有结合启动子的功能。lbd在模式植物拟南芥中发现参与调剂植物根、叶、花序和胚胎发育，也有参与植物花青素的合成以及氮代谢的调控。但该家族基因在草莓，尤其是草莓果实中的应用尚未见报道。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供falbd39基因在增加草莓果实中花青苷的积累中的应用，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第二个目的在于提供一种增加草莓果实中花青苷积累的方法，该方法包括通过调控草莓果实中falbd39基因的表达量，来调控草莓果实中花青苷的积累。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了falbd39基因在增加草莓果实中花青苷的积累中的应用，所述falbd39基因包括表达(a1)或(a2)的基因：

(a1)：含有如seqidno.1所示的氨基酸序列的蛋白；

(a2)：含有与(a1)所述的氨基酸序列70％以上同一性的氨基酸序列，且具有相同功能的蛋白。

进一步地，所述falbd39基因为表达含有如seqidno.1所示的氨基酸序列的蛋白的基因。

进一步地，所述falbd39基因的核苷酸序列包括(b1)或(b2)：

(b1)：含有如seqidno.2所示的核苷酸序列；

(b2)：含有与(b1)所述的核苷酸序列70％以上同一性，且具有相同功能的核苷酸序列。

进一步地，所述falbd39基因核苷酸序列为含有如seqidno.2所示的核苷酸序列。

进一步地，下调草莓果实中所述falbd39基因的表达，以增加草莓果实中花青苷的积累。

另外，本发明还提供了一种增加草莓果实中花青苷积累的方法，所述方法包括调控草莓果实中falbd39基因的表达量。

进一步地，下调所述falbd39基因的表达，以增加草莓果实中花青苷的积累。

进一步地，将falbd39基因与ptrv载体连接，得到重组质粒ptrv-falbd39，将所述重组质粒ptrv-falbd39在草莓果实中表达，增加草莓果实中花青苷的积累。

进一步地，利用农杆菌介导，实现重组质粒ptrv-falbd39在草莓果实中表达。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

(a)提供线性化的ptrv(pyl156)载体及带有ptrv(pyl156)载体重组片段的falbd39基因；

(b)将线性化的ptrv(pyl156)载体和带有ptrv(pyl156)载体重组片段的falbd39基因与重组酶共孵育后，转化感受态细胞，得到ptrv-falbd39质粒；

(c)将ptrv-falbd39质粒转化农杆菌gv3101，通过农杆菌介导，将falbd39基因转入草莓果实。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的发明人通过研究发现，falbd39基因的表达量对草莓果实中花青苷的积累具有重要的影响。因此，通过调控草莓果实中falbd39基因的表达，能够影响花青苷在草莓果实中的含量。下调草莓果实中falbd39基因的表达，能够增加草莓果实中花青苷的积累，使其具有更高的营养价值及市场价值。

本发明还提供了通过调控草莓果实中falbd39基因的表达量来增加草莓果实中花青苷积累的方法，该方法操作简单、成本较低，且相比于传统的向植物施与生长素、细胞分裂素和脱落酸等外源物质，直接调控草莓果实的基因能够更精准的调控草莓果实中花青苷的积累，调控效率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例4提供的不同处理方式下草莓果实状态的结果图。

图2为本发明实施例4提供的应用高效液相色谱hplc-dad技术检测草莓果实中总花青苷含量的结果图

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

根据本发明的一个方面，提供了falbd39基因在增加草莓果实中花青苷的积累中的应用，所述falbd39基因包括表达(a1)或(a2)的基因：

(a1)：含有如seqidno.1所示的氨基酸序列的蛋白；

(a2)：含有与(a1)所述的氨基酸序列70％以上同一性的氨基酸序列，且具有相同功能的蛋白。

含有如seqidno.1所示的氨基酸序列的蛋白指的是，所述蛋白的氨基酸序列可以为全部如seqidno.1所示的氨基酸序列，也可以由如seqidno.1所示的氨基酸序列和其他氨基酸组成，其他氨基酸在蛋白中的作用包括但不限于组成用于蛋白纯化的标签、荧光蛋标记物和dna的结合位点等，在一些具体的实施例中，例如可以为但不限于his、gst、myc、flag、hsv、v5、ha、gfp、rfp、bfp、cat、dhfr、mbp、t7或硫氧还蛋白等。

其中“同一性”指与seqidno.1所示的氨基酸序列的相似性。与seqidno.1所示的氨基酸序列的差异可能由一个或者几个氨基酸的改变、缺失或插入造成，这些改变使蛋白分子与seqidno.1所示的氨基酸序列不完全一致，但至少具有70％以上，例如可以为但不限于为70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性。同时，这些和seqidno.1所示的氨基酸序列有70％以上同一性的蛋白分子和含有seqidno.1所示的氨基酸序列的蛋白分子具有相同的功能。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价，例如使用本领域常规的blast软件进行比对。

其中所述falbd39基因为表达含有如seqidno.1所示的氨基酸序列的蛋白的基因时，应用于增加草莓果实中花青苷积累的效果较佳。

在一些可选的实施方式中，所述falbd39基因的核苷酸序列包括(b1)或(b2)：

(b1)：含有如seqidno.2所示的核苷酸序列；

(b2)：含有与(b1)所述的核苷酸序列70％以上同一性，且具有相同功能的核苷酸序列。

所述“含有”指的是所述falbd39基因核苷酸序列可以只含有如seqidno.2所示的核苷酸序列，也可以由seqidno.2所示的核苷酸序列和其他核苷酸序列组成，例如编码用于蛋白纯化的标签、荧光蛋标记物和dna的结合位点等功能单元的核苷酸序列，或者编码对基因转录和表达具有调节作用的元件，包括但不限于启动子、强启动子、增强子或转录因子结合位点等；所述“含有”还可以指如seqidno.2所示的核苷酸序列在falbd39基因中是不连续的，但是可以产生如seqidno.2所示的核苷酸序列的cdna。

其中“同一性”指与seqidno.2所示的核苷酸序列的相似性。与seqidno.2所示的核苷酸序列的差异可能由一个或者几个核苷酸的改变或者缺失或插入，以及密码子的简并性造成，这些改变使基因的序列与seqidno.2所示的核苷酸序列不完全一致，但至少具有70％以上，例如可以为但不限于为70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性。同时，这些和seqidno.2所示的核苷酸序列有70％以上同一性的基因和含有seqidno.2所示核苷酸序列的基因具有相同的功能。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价，例如使用本领域常规的blast软件进行比对。

其中所述falbd39基因为含有如seqidno.2所示的核苷酸序列的基因时，应用于增加草莓果实中花青苷积累的效果较佳。

falbd39基因的表达量对草莓果实中花青苷的积累具有重要的影响。因此，通过调控草莓果实中falbd39基因的表达，能够影响花青苷在草莓果实中的含量。本发明的发明人通过研究发现，下调草莓果实中falbd39基因的表达，能够增加草莓果实中花青苷的积累，使其具有更高的营养价值及市场价值。

根据本发明的第二方面，还提供了一种增加草莓果实中花青苷积累的方法，所述方法包括调控草莓果实中falbd39基因的表达量。

由于falbd39基因和草莓果实中花青苷的积累相关，因此调控草莓果实中falbd39基因的表达量能够调控草莓果实中花青苷的含量，且相比于传统的向植物施与生长素、细胞分裂素和脱落酸等外源物质，直接调控草莓果实的基因能够更精准的调控草莓果实中花青苷的积累，调控效率高。此外，本发明提供的方法还兼具操作简单、成本较低等优点。

由于增加草莓果实中花青苷的积累，能够使其具有更高的营养价值及市场价值，因此，在一些优选的实施方式中，下调草莓果实中falbd39基因的表达量，以增加草莓果实中花青苷的积累。其中，可以通过构建基因重组打靶载体、反义寡核苷酸技术、甲基化寡核苷酸技术或锌指核酸酶技术等调控falbd39基因的表达，本发明对此不做限定，凡是能够起到下调基因表达效果的方式均在本发明的保护范围之内。

在一些优选的实施方式中，将falbd39基因与ptrv载体连接，得到重组质粒ptrv-falbd39，将所述重组质粒ptrv-falbd39在草莓果实中表达，增加草莓果实中花青苷的积累。

vigs技术(病毒诱导的基因沉默[virus-inducedgenesilencing,vigs])具有周期短、成本低、不需要遗传转化等优点，在本实施方式中采用vigs技术能够鉴定基因的功能，从而为后期采用crispr/cas9等技术培育敲除falbd39基因的工程改良植株，提供理论指导。

在一些具体的实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(a)提供线性化的ptrv(pyl156)载体及带有ptrv(pyl156)载体重组片段的falbd39基因；

(b)将线性化的ptrv(pyl156)载体和带有ptrv(pyl156)载体重组片段的falbd39基因与重组酶共孵育后，转化感受态细胞，得到ptrv-falbd39质粒；

(c)将ptrv-falbd39质粒转化农杆菌gv3101，通过农杆菌介导，将falbd39基因转入草莓果实。

本发明利用现有植物基因工程技术，克隆了草莓花青苷相关基因falbd39，并通过农杆菌介导的转化方法将该基因转入草莓果实，经过比较分析证明，转基因果实中的花青苷积累量明显提高。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1调控草莓果实花青苷积累的基因falbd39的克隆

(1)、以八倍体草莓‘红颜’为试材。

(2)、rna提取：采用rna提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)，提取材料中的总rna之后用反转录试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)以rna为模板反转录得到cdna第一链。

(3)、基因的克隆：以反转录的cdna第一链为模板，利用引物falbd39-f和falbd39-r进行pcr扩增，回收pcr产物，获得765bp的目的片段。

falbd39-f:5’-atgagctgcaacggttgcc-3’(seqidno.3)；

falbd39-r:5’-tcaaacaaaaaggttcaaaagctt-3’(seqidno.4)。

将该片段连接到pgwc-t载体上，转化大肠杆菌dh5a，通过基因测序检验阳性克隆，从而获得pgwc-falbd39质粒。

实施例2草莓果实过表达载体的构建

(1)、本实施例优选植物过表达载体p3301-camv35s，选用ecor1(购自takara公司)对p3301-camv35s载体进行酶切，使其线性化。

(2)、以实施例1得到的pgwc-falbd39质粒为模板，利用引物falbd39-f1和falbd39-r1进行pcr扩增，克隆带有p3301-camv35s重组序列的片段，回收pcr产物，获得带有p3301载体重组片段的falbd39基因的pcr产物，所用引物如下：

falbd39-f1:5’-agcaggctttgactttatgagctgcaacggttgccga-3’(seqidno.5)；

falbd39-r1:5’-ttttgaacctttttgtttgaaaagtctctagaccca-3’(seqidno.6)。

(3)、将线性化的p3301-camv35s载体和带有p3301载体重组片段的falbd39基因的pcr产物，与重组酶(购自北京天根生化科技有限公司)均匀混合，55℃孵育15min，85℃灭活5min。转化大肠杆菌感受态dh5a(购自北京全式金生物技术有限公司)，测序鉴定重组子后，得到p3301-falbd39质粒，将该质粒转化农杆菌gv3101，得到含有重组质粒的农杆菌gv3101-p3301-falbd39菌株，该菌株可用于转化草莓果实。

实施例3草莓果实沉默载体的构建

(1)、本实施例优选植物沉默载体ptrv-falbd39，选用xbai(购自takara公司)对ptrv(pyl156)载体进行酶切，使其线性化。

(2)、以实施例1得到的pgwc-falbd39质粒为模板，利用引物falbd39-f2和falbd39-r2进行pcr扩增，克隆带有ptrv(pyl156)重组序列的片段，回收pcr产物，获得带有ptrv(pyl156)载体重组片段的falbd39基因的pcr产物，所用引物如下：

falbd39-f2:5’-aaaggtaccatgaggaaaccctgctgcga-3’(seqidno.7)；

falbd39-r2:5’-aaagaattctctgaagagaggaagcgtgg-3’(seqidno.8)。

(2)、将线性化的ptrv(pyl156)载体和带有ptrv(pyl156)载体重组片段的falbd39基因的pcr产物，与重组酶(购自北京天根生化科技有限公司)均匀混合，55℃孵育15min，85℃灭活5min。转化大肠杆菌感受态dh5a(购自北京全式金生物技术有限公司)，测序鉴定重组子，得到ptrv-falbd39质粒，将该质粒转化农杆菌gv3101，得到含有重组质粒的农杆菌gv3101-ptrv-falbd39菌株，该菌株可用于转化草莓果实。

实施例4转基因草莓果实的获得及表型分析

本实施例挑选长势一致的草莓植株30株，平均分为3组(对照组、过表达组和沉默组)，每株挑选1-2枚大小相似的果实进行转化试验，具体地：

(1)、falbd39过表达草莓果实的获得

将农杆菌株gv3101-p3301-falbd39接种于100ml含有kan(卡那霉素)50mg/l和rif(利福平)25mg/l的yep液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至od600＝1.0。3000rpm离心5分钟，去掉上清，加入10ml的ms盐溶液重悬菌体，置于28℃，100rpm振荡培养4h，之后注射入草莓果实中。

所述的ms盐溶液含有mgcl2、mes、乙酰丁香酮。

所述的草莓果实为长势一致的小绿果期的草莓果实。

(2)、falbd39沉默草莓果实的获得

将农杆菌株gv3101-ptrv-falbd39接种于100ml含有kan(卡那霉素)50mg/l和rif(利福平)25mg/l的yep液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至od600＝1.0。3000rpm离心5分钟，去掉上清，加入10ml的ms盐溶液重悬菌体，置于28℃，100rpm振荡培养4h，之后注射入草莓果实中。

所述的ms盐溶液含有mgcl2、mes、乙酰丁香酮。

所述的草莓果实为长势一致的小绿果期的草莓果实。

(3)、结果

将上述falbd39过表达草莓和falbd39沉默草莓培养至红熟期，随机摘取并对比观察，结果如图1所示，其中，a为对照组草莓果实，b为过表达组草莓果实，c为沉默组草莓果实。同时，应用高效液相色谱hplc-dad技术进行定量分析，检测上述草莓果实中总花青苷的含量，结果如图2所示。

从图1和图2中可以看出，将通过沉默或敲除等方式限制falbd39的表达，可以有效的增加草莓果实中花青苷的积累，从而提高草莓果实的营养价值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。