一株具核梭杆菌多形亚种分离株及其应用的制作方法

本发明涉及具核梭杆菌多形亚种领域，具体涉及一株具核梭杆菌多形亚种分离株及其应用。

背景技术：

结直肠癌作为最常见的几大肿瘤之一，死亡率高居所有肿瘤的第三位。由其造成的疾病负担一直是科学家们力争攻克的难题。随着测序等组学技术的发展，微生物在结直肠肿瘤发生发展的作用日渐引人关注，其中具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)与结直肠肿瘤发生发展的密切关联已得到多方验证。

具核梭杆菌为革兰阴性厌氧菌，在口腔中常规定植，正常情况下在体内其他部分罕见。在牙周炎的高细菌负荷中首次鉴定出了具核梭杆菌，长期以来一直被认为是机会性致病菌。此外，其致病性不仅局限于口腔，还可以迁延至口腔外的其他部位引起感染和炎症。在结直肠癌患者的肿瘤组织标本中，检测出了高丰度的具核梭杆菌。此后的研究更是进一步探讨了其与结直肠癌发生发展的因果联系，具核梭杆菌分泌的fada可与e-cadherin特异性结合，刺激肿瘤细胞生长，并影响β-catenin和wnt通路的转录调控，导致促癌基因表达增加。

具核梭杆菌分为多个亚种，相互之间基因组差异较大，但目前用于结直肠癌研究的具核梭杆菌标准株仅为具核亚种(f.nucleatumsubsp.nucleatum)，为atcc25586和atcc23726。atcc25586和atcc23726分别分离自口腔和阴道，而非肠道或肿瘤组织。因此，它们可能无法代表肠道中具核梭杆菌实际特性。目前来源于结直肠癌肿瘤组织的具核梭杆菌，尤其是多形亚种，鲜有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一株具核梭杆菌多形亚种分离株thct15e1及其在结直肠癌研究中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一株具核梭杆菌多形亚种分离株thct15e1，该菌株的16srrna基因序列具体如下所示：

>16s_rrna_genethct15e1[cctccm2019362]

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进一步地，该菌株分类命名为fusobacteriumnucleatumsubsp.polymorphumthct15e1，其保藏编号为cctccno：m2019362，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。

进一步地，该菌株分离自人类结肠隆起型腺癌肿瘤组织。分离培养采用具核梭杆菌筛选培养基，其含有硫酸新霉素、万古霉素和结晶紫等作为筛选条件。组织立体后迅速被机械打碎，稀释10²-10⁴倍，铺于具核梭杆菌筛选培养基，37℃于厌氧罐中培养获得。所得菌株的培养条件为37℃厌氧培养，培养基可用一般营养丰富型培养基如哥伦比亚血平板、硫乙醇酸盐流体培养基，亦可采用其它适用于梭杆菌的培养基。

进一步地，该菌株经革兰染色后镜下呈红色、梭杆状，呈丝状排布。

本发明的第二方面是提供一种具核梭杆菌多形亚种分离株thct15e1在构建体外或体内模拟肠道环境的实验条件中的应用。

本发明的第三个方面是提供一种具核梭杆菌多形亚种分离株thct15e1在筛选治疗结直肠癌药物中的应用。

进一步地，结直肠癌细胞系为hct116细胞系或lovo细胞系。

本发明提供的具核梭杆菌多形亚种分离株thct15e1显著促进结直肠癌肿瘤细胞系的增殖，因此thct15e1可为结直肠癌的研究提供多样性的体外或体内模拟肠道环境的实验条件，从而建立结直肠癌的疾病模型来筛选药物或者制备药物。

附图说明

本发明的公开的一株具核梭杆菌多形亚种分离株为thct15e1，其已进行保藏，分类命名为fusobacteriumnucleatumsubsp.polymorphumthct15e1，其保藏编号为cctccno：m2019362，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。

图1为本发明一实施例中hct116细胞系与thct15e1共培养后的增殖情况表示图(其中，左图为hct116细胞生长曲线；右图为共培养72小时增殖情况比较(双尾t检验p<0.01))；

图2为本发明一实施例中lovo细胞系与thct15e1共培养后的增殖情况表示图(其中，左图为lovo细胞生长曲线；右图为共培养72小时增殖情况比较(双尾t检验p<0.01))。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

一株分离自人类结肠隆起型腺癌肿瘤组织的具核梭杆菌多形亚种分离株thct15e1，现已被保藏，分类命名为fusobacteriumnucleatumsubsp.polymorphumthct15e1，其保藏编号为cctccno：m2019362，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。该菌株的16srrna基因序列如seqidno:1所示，与f.nucleatumsubsp.polymorphum菌株atcc10953的16srrna基因序列(ncbi登录号nr_113141.1)有99.59％一致性，与f.nucleatumsubsp.nucleatum菌株atcc25586的16srrna基因序列(ncbi登录号nr_114702.1)有97.77％一致性。

该分离株在哥伦比亚培养基上培养7天后，形成相对较大、圆形、边缘不规则、半透明、表明不光滑、白色菌落。该组织为新鲜手术切除标本。所用的分离培养基为梭杆菌选择培养基。

测定该菌株的基因组，发现基因组包含一条环状染色体和一个环形质粒，其中染色体大小为2515213bp，gc含量为26.87％，质粒大小为11001bp，gc含量为26.66％。基因组共含有2395个蛋白编码基因、65个非编码基因(46个trna基因、5套5s-16s-23srrna基因和4个srna基因)。经jspecies软件分析其相对f.nucleatumsubsp.nucleatum菌株atcc25586(ncbi基因组登录号：gca_003019295.1)的全基因组anib值为91.53，相对f.nucleatumsubsp.polymorphum菌株nctc10562(ncbi基因组登录号：gca_001457555.1)的全基因组anib值为96.42，说明其属于多形(polymorphum)亚种，命名为thct15e1。anib，即averagenucleotideidentityusingblast(基于blast的平均核苷酸序列一致性)，是一种评价菌株亲缘性的指标，一般认为≥95即同属一种。

以下通过具体实施例验证具核梭杆菌多形亚种分离株thct15e1可促进结直肠癌细胞系增殖。

实施例一

thct15e1与结直肠癌hct116细胞系共培养，具体的操作步骤如下：

胰酶消化制备已培养的hct116细胞悬液，计数后接种至24孔板(1×10⁵个细胞/孔)，培养12-24小时直至细胞贴壁。贴壁后用pbs洗涤并更换无抗培养基。新鲜制备的thct15e1细菌，并用pbs悬浮，细菌悬浮液加入实验组(1×10⁸cfu/孔)；对照组加入等体积pbs。每组分别做3个重复孔。放于常规条件下培养。分别在培养至6小时、24小时、48小时、72小时采用cck8法检测细胞增殖活性。其中每隔24小时，更换一次细菌悬浮液。

由图1可知hct116细胞在72小时的增殖活性显著高于对照组(p<0.01)，说明thct15e1可显著促进hct116细胞增殖。

实施例二

thct15e1与结直肠癌lovo细胞系共培养，具体的操作步骤如下：

胰酶消化制备已培养的lovo细胞悬液，计数后接种至24孔板(1×10⁵个细胞/孔)，培养12-24小时直至细胞贴壁。贴壁后用pbs洗涤并更换无抗培养基。新鲜制备的thct15e1细菌，并用pbs悬浮，细菌悬浮液加入实验组(1×10⁸cfu/孔)；对照组加入等体积pbs。每组分别做3个重复孔。放于常规条件下培养。分别在培养至6小时、24小时、48小时、72小时采用cck8法检测细胞增殖活性。其中每隔24小时，更换一次细菌悬浮液。

由图2可知lovo细胞在72小时的增殖活性显著高于对照组(p<0.01)，说明thct15e1可显著促进lovo细胞增殖。

以上实施例说明具核梭杆菌多形亚种分离株thct15e1显著促进结直肠癌肿瘤细胞系的增殖。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>上海市第十人民医院

<120>一株具核梭杆菌多形亚种分离株及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1494

<212>dna

<213>16s_rrna_genethct15e1[cctccm2019362]

<400>1

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