一种缺氮联合独脚金内酯促进单针藻积累油脂的方法与流程

本发明属于生物柴油技术领域，具体涉及一种缺氮联合独脚金内酯促进单针藻积累油脂的方法。

背景技术：

近年来，化石能源过度使用导致的环境污染、能源短缺等问题日益严重，生物柴油作为化石能源的理想替代品引起了人们广泛的关注，它可以通过动植物油的转酯反应来制备，其性能指标好控制，稳定性好。生物柴油(biodiesel)，即脂肪酸甲酯，是一种含氧清洁燃料，由菜籽油、大豆油、回收烹饪油、动物油、微生物油脂等可再生油脂与短链醇类经转酯化而形成的混合脂类。生物柴油作为优质的柴油代用品，是一种可再生、生物可降解、稳定性好和无毒的燃料,属环境友好型绿色燃料,具有深远的经济效益与社会效益。

微藻作为生产生物柴油的一种可再生原料，具有分布广、生物量大、光合效率高、环境适应能力强、生长周期短、油脂含量高和环境友好等优点已被广泛研究，有望破解后石油时代的能源危机。因此，利用微藻生产生物柴油具有广阔的发展前景。微藻的生长模式有自养、异养、兼养。现在主要采用的是自养培养，但是该培养方式微藻具有藻细胞生长周期过长、产率低、易染菌和采收成本高等原因，导致不能大规模的应用；同时，在微藻培养过程中，除培养方式影响以外，光照、温度、金属离子、非生物胁迫和植物激素等也同样对生长和油脂积累有显著性影响。单针藻属于一种单细胞绿色微藻，有研究表明在非生物胁迫条件下，比如在氮缺陷条件下，会引发藻细胞的氧化损伤，进而促进了细胞内脱落酸(abscisicacid,aba)和吲哚乙酸(indoleaceticacid,iaa)的合成，aba和iaa可以与活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)相互作用，减缓由氮缺陷引起的细胞氧化损伤，进而促进油脂的大量积累。植物激素作为微藻新陈代谢过程中的信使，可以调控微藻的生长和代谢物的积累。有研究指出，在赤霉素作用下，破囊壶菌的生物量和油脂含量相比对照分别提高了14.4％和43.6％；在黄腐酸的作用下，维持细胞生物量稳定的情况下，促进了单针藻油脂含量的积累。独脚金内酯(strigolactones，sls)是一类类胡萝素衍生物，不仅广泛存在于植物体内，还存在于苔藓、轮藻及绿藻内。最新研究证明独脚金内酯是一种可调控植物株型发育的新型植物激素，能够调控侧芽伸长,株高,叶片形状,衰老,种子萌发,侧根生长等发育过程。可作为一种长距离信号分子参与生长素和细胞分裂素共同调控植物侧枝的生长而维持植物的株型。同时是介导植物寄主与其寄生或共生生物互作的一种信号分子。在调控细胞与细胞及细胞与环境的相互作用中起着至关重要的作用。目前,独脚金内酯已成为国际研究热点。独脚金内酯(sls)作为一种植物激素可以对植物在非生物胁迫条件下，发挥关键的调节作用；缺氮联合独脚金内酯(sls)作用，与第二信使no一样，独脚金内酯(sls)作为信号分子，当外界环境产生胁迫，独脚金内酯(sls)接收胁迫信号并与ca²⁺、aba和ck等发生关联，从而有利于油脂含量的积累。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种缺氮联合独脚金内酯促进单针藻积累油脂的方法，该方法为两阶段培养，具体为第一阶段利用异养bg-11基础培养基培养微藻至对数生长后期；第二阶段利用自养的缺氮bg-11联合独脚金内酯(sls)培养微藻油脂积累的方法；同时促进微藻生物量和油脂含量的增加，该方法过程简单。具体包括以下步骤：

a、以葡萄糖为碳源的bg-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞；

b、制备诱导的培养基：将缺乏氮源的bg-11培养基作为产油单针藻的诱导培养基，调整ph值至6.8-7.0，配置成培养基；

c、产油微藻培养：将步骤(b)所得培养基在121℃条件下进行20min高温高压灭菌，接入步骤(a)中的藻细胞，初始接种量为0.7-1g/l，然后加入丙酮用来溶解独脚金内酯，配制浓度为1mmol/l的独脚金内酯母液，使培养基中独脚金内酯最终的浓度为1μmol/l，并将藻液置于摇床中光照培养，得到最终的培养液。

进一步的，步骤(a)中所述bg-11基础培养基配方为：

进一步的，步骤(c)所述的高温高压条件是在高压灭菌锅设置灭菌程序实现的。

进一步的，步骤(a)中基础培养基中葡萄糖的加入量为9-11g/l。

进一步的，步骤(a)培养单针藻的温度为24-26℃。

进一步的，步骤(b)所述的bg-11培养基中硝酸钠(nano3)的添加量为0g/l。

进一步的，步骤(c)中所述光照培养具体为光照培养温度为23-26℃，光照强度为3500-4500lux，所述摇床转速为130-160r/min。

进一步的，制备生物柴油：将由(c)得到的培养液在3400-3600r/min转速条件下离心10-15min，并以蒸馏水反复洗涤2-3次后置于-80℃冷冻2h以上后冻干，称取干藻粉加入石英砂研磨20-30min，然后用3-4ml氯仿-甲醇的混合溶液进行油脂提取，重复提取2-3次后收集有机相进行浓缩，提取得到的油脂加入2ml3％硫酸-甲醇进行甲酯化制备得到生物柴油。

进一步的，所述干藻粉与石英砂比例为1：2，所述氯仿-甲醇的体积比为2：1，所述硫酸-甲醇的体积比为3：97。

本发明的有益效果是：

本发明操作简单易行，节省氮源，原材料为自己筛选的单针藻菌株可按常规方法培养。本发明利用光自养，再添加诱导因子诱导缺氮的藻细胞积累油脂，通过此两阶段培养微藻的方法，既实现了微藻的快速高密度生长，又实现了微藻的高品质培养；与第二阶段只缺氮条件下培养相比发现，在缺氮条件下又添加外源独脚金内酯(sls)可有效促进微藻细胞中油脂的积累，油脂含量有较大幅度的提升，藻细胞中最大油脂含量达到了53.71％，比对照组提高了25.37％，从而证明缺氮联合独脚金内酯(sls)能够显著的促进产油微藻油脂含量的积累。因此，在缺氮条件下，联合植物激素作用更有利于微藻生长和油脂含量的积累。

附图说明

图1为对照例1和实施例1至3的结果分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例及图1对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

对照例1

配制自养bg-11基础培养基，作为产油微藻的基本培养基，调整ph值为6.8-7.0；高压高温灭菌20min，接入产油单针藻，藻细胞浓度控制在0.7g/l，向基础培养基中不添加sls使得最终的sls浓度为0μm，光照培养温度为25℃，光照强度为3500lux，摇床转速为150r/min，进行光照摇瓶培养。本对照例培养的产油单针藻最大油脂含量达到了41.57％；最大生物量达到了0.89g/l。

实施例1

配制缺氮的自养bg-11培养基，作为产油微藻的基本培养基，调整ph值为6.8-7.0；高压高温灭菌20min，接入产油单针藻，藻细胞浓度控制在0.7g/l，不添加sls，光照培养温度为25℃，光照强度为3500lux，摇床转速为150r/min，进行光照摇瓶培养。本实施例培养的产油单针藻最大油脂含量达到了46.18％；最大生物量达到了0.86g/l。

实施例2

配制自养bg-11基础培养基，作为产油微藻的基本培养基，调整ph值为6.8-7.0；高压高温灭菌20min，接入产油单针藻，藻细胞浓度控制在0.7g/l，向培养基中加入sls使得最终的sls浓度为1μm，光照培养温度为25℃，光照强度为3500lux，摇床转速为150r/min，进行光照摇瓶培养。本对照例培养的产油单针藻最大油脂含量达到了48.76％；最大生物量达到了0.91g/l。

实施例3

配制缺氮的自养bg-11培养基，作为产油微藻的基本培养基，调整ph值为6.8-7.0；高压高温灭菌20min，接入产油单针藻，藻细胞浓度控制在0.7g/l，向培养基中加入sls使得最终的sls浓度为1μm，光照培养温度为25℃，光照强度为3500lux，摇床转速为150r/min，进行光照摇瓶培养。本实施例培养的产油单针藻最大油脂含量达到了53.71％；最大生物量达到了0.90g/l。

将对照例1以及实施例1至3得到的培养液离心富集(3500r/min，10min)，并以蒸馏水反复洗涤2次后冻干称重；添加冻干藻粉2倍质量石英砂研磨20min后用氯仿-甲醇(2:1，v/v)进行油脂提取，有机溶剂重复提取3次后收集有机相浓缩称重，上述提取油脂加2ml3％硫酸-甲醇进行甲酯化制备得到生物柴油。

结果表明：利用异养-光自养两阶段的方法，第一阶段异养促进微藻积累生物量；第二阶段光自养缺氮联合sls进一步促进微藻中油脂的快速积累。通过此两阶段培养微藻的方法，既实现了微藻的快速高密度生长，又实现了微藻的高品质培养。且在缺氮条件下，藻细胞内油脂含量与对照组相比提高了11.09％，达到了46.18％。外源sls联合缺氮条件下藻细胞油脂含量与对照组相比提高了29.20％，达到了53.71％，较正常的微藻油脂含量有了大幅提高。

以上所述，仅是本发明的较佳案例，并不对本发明做出任何限制，凡是针对本发明技术内容对以上实施案例所做的任何简单修改、变更、模仿均属于本发明技术方案的保护范围。