一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法与流程

本发明涉及一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法。

背景技术：

蔗糖是甜高粱茎秆糖分的主要存在形式，蔗糖在茎秆中的积累关系到甜高粱茎秆中的糖分含量和产量，而茎秆糖分积累过程与蔗糖代谢酶密不可分。植物蔗糖代谢包括蔗糖合成、运输和转化。蔗糖代谢由多种酶调控，与蔗糖代谢和积累密切相关的酶主要有蔗糖磷酸合成酶(sps)、蔗糖合成酶(ss)和转化酶(inv)。蔗糖合成的限速酶是果糖1，6-二磷酸酯酶(fbpase)和磷酸蔗糖合成酶(sps)。蔗糖降解由代谢关键酶转化酶、蔗糖合成酶等参与调节。

蔗糖合成酶(sucrosesynthase，e.c.2.4.1.13)是一种可溶性酶，分子量范围为280-540，由分子量约为83kd-100kd的亚基构成的四聚体。蔗糖合成最适ph值为8.0～9.5，蔗糖裂解最适ph值为5.5～6.5。蔗糖磷酸合成酶(sucrosephosphatesynthase，e.c.2.4.1.14)广泛存在于植物光和组织和非光和组织中，是一种可溶性酶，由分子量117kd-138kd的亚基构成，为二聚体或四聚体，是一种低丰度蛋白(不到可溶性蛋白的0.1％)，且不稳定。以不同发育时期的甜高粱和采后不同贮藏方式甜高粱茎秆为实验材料，旨在了解高粱茎秆的ss和sps的含量变化，为甜高粱品质研究提供理论依据。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法，包括以下步骤：

(1)蔗糖标准曲线的制作；

(2)酶液的制备；

(3)蔗糖合成酶或蔗糖磷酸合成酶活性的测定：

向试管中加入0.05m果糖溶液或f6p溶液0.1ml，udpg0.1ml，0.1mtris溶液0.1ml，0.05ml10mmmgcl2溶液，向空白试管中加入0.1ml10％naoh溶液，向所有待测样品试管中加入酶液0.2ml；将上述试管全部放入37℃水浴中保温30min；接着取出在沸水浴中加热1min，流水冷却；随后向样品试管中加0.1ml10％naoh溶液，沸水浴加热10min，流水冷却；接着将上述试管全部加入3.5ml36％hcl，85℃水浴加热10min，流水冷却；然后将上述试管全部加入0.5ml0.1％间苯二酚溶液，65℃水浴加热10min，流水冷却；接着加入4.5ml蒸馏水，摇匀；最后在480nm下比色；结果按照以下公式计算：单位为：mg·g^-1·h^-1

其中：x：标准曲线上查得蔗糖含量(100μg/ml)

v1：样品总体积(ml)

v2：测定时取酶液体积(ml)

m：样品质量(g)

t：酶反应时间(h)。

作为优选，步骤(1)中，所述蔗糖标准曲线的制作方法为：准备一系列不同浓度的蔗糖溶液，然后加入naoh溶液，沸水浴加热，并冷却；接着加入hcl溶液，80℃水浴加热，并冷却；随后加入间苯二酚溶液，65℃水浴加热，并冷却；最后在480nm下比色，以蔗糖含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制蔗糖标准曲线。

作为优选，步骤(2)中，所述酶液的制备方法为：在植物样品中加入磷酸缓冲液并匀浆，研磨浆液，然后将研磨好的浆液离心，取上清液。

本发明的方法能够准确的测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为不同贮藏方式对甜高粱茎秆蔗糖合成酶活力变化的影响。

图2为不同贮藏方式对甜高粱茎秆蔗糖磷酸合成酶活力变化的影响。

图3是蔗糖标准曲线图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1材料与方法

1.1材料

甜高粱茎杆：于玛纳斯采收。

1.2试验方法

甜高粱收获后除去高粱穗，秸秆分别采取整秆去叶立放、整秆去叶平放、整秆带叶立放、整秆带叶平放和金字塔型堆放等九种贮藏方式。在自然条件下贮藏，整秆型贮藏方式采取50根捆扎为一组；金字塔型堆放贮藏方式为：去叶去穗后茎秆截为20厘米长的短杆，每50个短杆捆扎为一组，堆放方式为单层(七组放一层)、双层(第一层七组，第二层六组)、三层、四层和五层(三种方式均为第一层七组，以后每层递减一组)。

两个品种采样时间为：采收前选取抽穗期、成熟期、完熟期三个时期，采收后220d贮藏期间每10d取一次样，对两个品种甜高粱茎秆水份、总糖、还原糖、蔗糖、可溶性糖、总酸等指标进行测定。

1.3测定方法

1.3.1蔗糖合成酶活性的测定

1.3.1.1蔗糖标准曲线的制作

表1蔗糖标准曲线的制作

按照表1中标示的量在1至6号试管中分别加入上述试剂，然后加入0.1ml10％naoh溶液，沸水浴加热10min，流水冷却；接着加入3.5ml36％hcl溶液，80℃水浴加热10min，流水冷却；随后加入0.5ml0.1％间苯二酚溶液，65℃水浴加热10min，流水冷却；最后在480nm下比色。以蔗糖含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.1.2酶液的制备

称取2g样品，加10mlph7磷酸缓冲液，用高速匀浆机匀浆；研钵中可加入少许石英砂，研磨打好的浆液；将匀好的浆液在3500r/min转速下离心10min。取出适量上清液备用。

1.3.1.3蔗糖合成酶(ss)活性的测定

向试管中加入0.05m果糖溶液0.1ml，udpg0.1ml，0.1mtris溶液0.1ml，0.05ml10mmmgcl2溶液，向空白试管中加入0.1ml10％naoh溶液，向所有待测样品试管中加入酶液0.2ml；将上述试管全部放入37℃水浴中保温30min；接着取出在沸水浴中加热1min，流水冷却；随后向样品试管中加0.1ml10％naoh溶液，沸水浴加热10min，流水冷却；接着将上述试管全部加入3.5ml36％hcl，85℃水浴加热10min，流水冷却；然后将上述试管全部加入0.5ml0.1％间苯二酚溶液，65℃水浴加热10min，流水冷却；接着加入4.5ml蒸馏水，摇匀；最后在480nm下比色。

结果按以下公式计算：单位(mg·g^-1·h^-1)

其中：x：标准曲线上查得蔗糖含量(100μg/ml)

v1：样品总体积(ml)

v2：测定时取酶液体积(ml)

m：样品质量(g)

t：酶反应时间(h)。

1.3.2蔗糖磷酸合成酶(sps)活性的测定

1.3.2.1蔗糖标准曲线的制作

同1.3.1.1。

1.3.2.2酶液的制备

同1.3.1.2。

1.3.2.3蔗糖磷酸合成酶(sps)活性的测定

向试管中加入0.05mf6p溶液0.1ml，udpg0.1ml，0.1mtris溶液0.1ml，0.05ml10mmmgcl2溶液，向空白试管中加入0.1ml10％naoh溶液，向所有待测样品试管中加入酶液0.2ml；将上述试管全部放入37℃水浴中保温30min；接着取出在沸水浴中加热1min，流水冷却；随后向样品试管中加0.1ml10％naoh溶液，沸水浴加热10min，流水冷却；接着将上述试管全部加入3.5ml36％hcl，85℃水浴加热10min，流水冷却；然后将上述试管全部加入0.5ml0.1％间苯二酚溶液，65℃水浴加热10min，流水冷却；接着加入4.5ml蒸馏水，摇匀；最后在480nm下比色。

结果按以下公式计算：单位(mg·g^-1·h^-1)

其中：x：标准曲线上查得蔗糖含量(100μg/ml)

v1：样品总体积(ml)

v2：测定时取酶液体积(ml)

m：样品质量(g)

t：酶反应时间(h)。

2结果与分析

2.1蔗糖标准曲线

蔗糖标准曲线见图3。

由图3可知：标准曲线方程为y＝0.9293x-0.0650，线性范围为r＝0.9998。

2.2采收前不同时期生理指标含量

表2甜高粱秆采收前生理指标含量比较

由表2可以看出，两品种甜高粱茎秆ss和sps两种酶活力均在抽穗期略低，在成熟期和完熟期略有回升。总体来看，新高粱3号在各个生长时期生理指标均高于新高粱4号。

2.3贮藏期间蔗糖合成酶活力变化

贮藏期间蔗糖合成酶活力变化结果见图1。

图1为不同贮藏方式对甜高粱茎秆蔗糖合成酶活力变化的影响。

由图1a、b看出，在0-220d贮藏期间内，在所有贮藏方式下，3号和4号甜高粱茎秆蔗糖合成酶(ss)活力总体下降呈趋势，茎秆蔗糖合成酶(ss)活力由高到低依次为整秆去叶立放＞整秆去叶平放＞整秆带叶立放＞整秆带叶平放＞金字塔型，而金字塔型蔗糖合成酶(ss)活力由高到低依次为五层＞四层＞三层＞双层＞单层。由图1c、d看出，220d贮藏期内，同一贮藏方式下，3号甜高粱茎秆的蔗糖合成酶(ss)活力始终比4号茎秆高。3号甜高粱茎秆整秆去叶立放型蔗糖合成酶(ss)活力从9.06降至5.53(mg·g^-1·h^-1,fw)，带叶平放型蔗糖合成酶(ss)活力从9.06降至4.58(mg·g^-1·h^-1,fw)；而4号甜高粱茎秆整秆去叶立放型蔗糖合成酶(ss)活力从8.96降至5.35(mg·g^-1·h^-1,fw)，带叶平放型蔗糖合成酶(ss)活力从8.96降至4.48(mg·g^-1·h^-1,fw)。金字塔型贮藏方式中，金字塔五层贮藏方式蔗糖合成酶(ss)最高，其中3号甜高粱茎秆220d蔗糖合成酶(ss)活力降至2.48(mg·g^-1·h^-1,fw)，单层含量最低，降至1.66(mg·g^-1·h^-1,fw)；而4号金字塔五层贮藏方式甜高粱茎秆220d蔗糖合成酶(ss)活力降至2.16(mg·g^-1·h^-1,fw)，单层降至1.38(mg·g^-1·h^-1,fw)。

2.4贮藏期间蔗糖磷酸合成酶活力变化

贮藏期间蔗糖磷酸合成酶活力变化结果见图2。

图2为不同贮藏方式对甜高粱茎秆蔗糖磷酸合成酶活力变化的影响。

由图2a、b看出，在0-220d贮藏期间内，在所有贮藏方式下，3号和4号甜高粱茎秆蔗糖磷酸合成酶(sps)活力总体下降呈趋势，茎秆蔗糖磷酸合成酶(sps)活力由高到低依次为整秆去叶立放＞整秆去叶平放＞整秆带叶立放＞整秆带叶平放＞金字塔型，而金字塔型蔗糖磷酸合成酶(sps)活力由高到低依次为五层＞四层＞三层＞双层＞单层。由图2c、d看出，220d贮藏期内，同一贮藏方式下，3号甜高粱茎秆的蔗糖磷酸合成酶(sps)活力始终比4号茎秆高。3号甜高粱茎秆整秆去叶立放型蔗糖磷酸合成酶(sps)活力从9.04降至5.51(mg·g^-1·h^-1,fw)，带叶平放型蔗糖磷酸合成酶(sps)活力从9.04降至4.52(mg·g^-1·h^-1,fw)；而4号甜高粱茎秆整秆去叶立放型蔗糖磷酸合成酶(ss)活力从8.90降至5.32(mg·g^-1·h^-1,fw)，带叶平放型蔗糖磷酸合成酶(sps)活力从8.90降至4.38(mg·g^-1·h^-1,fw)。金字塔型贮藏方式中，金字塔五层贮藏方式蔗糖磷酸合成酶(sps)最高，其中3号甜高粱茎秆220d蔗糖磷酸合成酶(sps)活力降至2.40(mg·g^-1·h^-1,fw)，单层含量最低，降至1.62(mg·g^-1·h^-1,fw)；而4号金字塔五层贮藏方式甜高粱茎秆220d蔗糖磷酸合成酶(sps)活力降至2.12(mg·g^-1·h^-1,fw)，单层降至1.21(mg·g^-1·h^-1,fw)。

2.5蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶精密度试验

酶测定的精密度试验(n＝6)

由上表可以看出，样品中蔗糖合成酶含量(ss)、蔗糖磷酸合成酶含量(sps)基本保持不变，其rsd值分别为0.2522％和0.2504％，均小于1％，说明应用该方法测定这两种酶的精密度较高。

2.6加标回收率试验

不是用液相方法测定的酶含量，是用比色法，所以没办法做加标回收率试验。

3结论与讨论

0-220d贮藏期间内，不同贮藏方式下(去叶立放、去叶平放、带叶立放、带叶平放、金字塔型)，3号和4号甜高粱茎秆ss和sps活力均呈下降趋势。同一种贮藏方式下3号甜高粱茎秆的ss和sps活力始终比4号茎秆高。茎秆ss和sps活力由高到低依次为整秆去叶立放＞整秆去叶平放＞整秆带叶立放＞整秆带叶平放＞金字塔五层＞金字塔四层＞金字塔三层＞金字塔二层＞金字塔一层。

贮藏期内同一种贮藏方式下3号甜高粱茎秆的ss和sps活力始终比4号茎秆高，可能与完熟期时3号甜高粱茎秆的ss和sps活力比4号茎秆高有关。

甜高粱秆贮藏期间这两种酶的变化主要由蔗糖的合成与代谢决定。通过对sps酶活力的测定，可以了解sps与蔗糖积累相关性。在甜高粱成熟过程中，蔗糖积累与库组织中的sps活性的升高密切相关，sps与转化酶协同控制蔗糖长途运输与库组织蔗糖代谢。sps活性与淀粉积累呈负相关，而与蔗糖积累呈正相关，sps的活性直接影响光合作用在淀粉与蔗糖之间的分配。在甜高粱茎秆生长发育过程中，ss既能起到催化蔗糖合成的作用，又可以催化蔗糖分解，但主要起到分解蔗糖的作用，ss活性和库强度与蔗糖输入呈正相关，表明ss对源、库器官碳水化合物的分配有调控作用。

本发明以新高粱3号和4号甜高粱茎秆为试验材料，研究了甜高粱茎秆采后220天贮藏期内不同贮藏方式下(去叶立放、去叶平放、带叶立放、带叶平放、金字塔型)蔗糖合成酶(ss)和蔗糖磷酸合成酶(sps)含量的变化。结果表明：在0-220d贮藏期间内，所有贮藏方式下，3号和4号甜高粱茎秆蔗糖合成酶(ss)和蔗糖磷酸合成酶(sps)含量均呈下降趋势。同一种贮藏方式下3号甜高粱茎秆的蔗糖合成酶(ss)和蔗糖磷酸合成酶(sps)含量始终比4号茎秆高。在整个贮藏期茎秆蔗糖合成酶(ss)和蔗糖磷酸合成酶(sps)含量由高到低依次为整秆去叶立放＞整秆去叶平放＞整秆带叶立放＞整秆带叶平放＞金字塔五层＞金字塔四层＞金字塔三层＞金字塔二层＞金字塔一层。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。