锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种锦鲤gtpch2基因、编码蛋白及其应用。

背景技术：

体色是鱼类的重要表型性状之一，由色素细胞形成。鱼类皮肤及鳞片中色素细胞的种类、数量和分布都会影响其体色。色素细胞由外胚层神经嵴细胞分化形成。在胚胎发育过程中，神经嵴细胞沿背腹轴分化成包括色素细胞在内的不同类型细胞。相对于哺乳动物只具有一种黑色素细胞，鱼类具有六种色素细胞，包括黑色素细胞、红色素细胞、黄色素细胞、虹彩细胞、蓝色素细胞和白色素细胞。蝶啶代谢通路在斑马鱼（daniorerio）和花鳉（poeciliareticulata）等鱼类中是调控体色变化的一条重要代谢通路。蝶啶代谢通路的终产物为黄色和微红的蝶啶色素。碟啶是由嘧啶和吡嗪环组成的杂环复合物，根据结构可以分为蝶呤和黄素两种类型。这些喋啶色素是以gtp为底物经过该通路转化而来，gtpch（gtpcyclohydrolase）是碟啶合成通路的关键酶，对黄色素、蝶啶、果蝇蝶呤等色素的合成起重要的调控作用。gtpch参与三个途径用于bh4和蝶啶色素化合物的合成：bh4的从头合成，氧化bh4的补救合成途径和参与生成黄色嘌呤色素/红色蝶啶色素。

锦鲤（cyprinuscarpiovar.koi）属于鲤科（cyprinidae）、鲤属（cyprinus），因体色丰富且组合形式多样化深受人们喜爱，是研究鱼类乃至脊椎动物体色变化的重要模式动物。目前为止，所有的锦鲤品系基本由杂交选育获得。但经杂交选育的锦鲤性状极不稳定，具有较高观赏价值的锦鲤个体很少。gtpch蛋白参与生成黄色嘌呤色素/红色蝶啶色素。通过解析gtpch2基因的功能，确定其在锦鲤黄色素和红色素形成中的作用，有助于定向培养体色遗传性状稳定的锦鲤，降低了锦鲤选育的成本，同时提高观赏鱼类的观赏性，对锦鲤乃至观赏鱼养殖业具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种锦鲤gtpch2基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌株及其在检测鱼类gtpch2免疫印迹、免疫组化和组织定位分布中的应用。

本发明为实现上述目的采用如下技术方案，锦鲤gtpch2基因，其特征在于：该锦鲤gtpch2基因的核苷酸序列如seqidno:2所示。

本发明克隆了锦鲤gtpch2基因，并得到了3'utr和部分5'utr。克隆的方法是常规的基因克隆方法，利用同源物种的基因比对设计简并引物，经过pcr后得到中间片段，然后根据中间片段的序列分别设计两个5'race的下游引物和两个3'race的上游引物，在利用通用引物upm-l和upm-s进行5'和3'嵌套pcr得到了gtpch2的orf、5'utr和3'utr。最后设计克隆orf的引物，pcr后把得到目的基因连接到pmd-19载体为pmd-19-gtpch2。

本发明构建了含有锦鲤gtpch2的大肠杆菌表达载体，这个载体的构建方法是按常规方法利用自己所构建的载体pmd-19-gtpch2为模板，通过pcr方法合成带有酶切接头的锦鲤gtpch2基因，经酶切和分离纯化后接入到已有的载体pet32a的相应酶切位点即bamhi和saci之间，即构建成所需的含有锦鲤gtpch2基因的表达载体pet32a-gtpch2。

本发明还用上述含有锦鲤gtpch2基因的相应表达载体构建了能高效表达锦鲤gtpch2基因的大肠杆菌重组株。

本发明的上述能表达锦鲤gtpch2大肠杆菌重组菌株由含有锦鲤gtpch2基因的表达载体pet32a-gtpch2转化大肠杆菌bl21而得到的菌株，命名为pet32a-gtpch2-bl21。

本发明还提供了利用上述大肠杆菌重组株生产锦鲤gtpch2的方法。将该菌种接种在lb液体培养基中，37℃，200转/分培养至od600达到0.4-0.6，然后加入iptg至终浓度为1mm，37℃，200转/分培养4小时后5000g离心10min收集菌体，超声破碎后12000g离心10min收集上清，经分离纯化得到重组锦鲤gtpch2蛋白。

锦鲤具有较高的经济价值，采用常规的基因工程技术，可利用本发明的锦鲤gtpch2基因重组株pet32a-gtpch2-bl21，生产重组锦鲤gtpch2蛋白，并可进一步通过免疫组化和免疫印迹的方法检测gtpch2蛋白在鱼类组织的分布和定位。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次克隆获得锦鲤gtpch2基因，并将该基因构建表达载体和重组大肠杆菌菌株，利用重组大肠杆菌菌种在体外获得大量表达的锦鲤gtpch2蛋白，该蛋白可以用于免疫组化和免疫印迹等组织免疫学实验，检测和分析gtpch2蛋白鱼类组织中的表达和定位。

附图说明

图1是以棉鲤的反转录cdna为模板进行pcr扩增gtpch2orf产物的凝胶电泳分析图，其中，m：marker；1和2：pcr扩增产物；

图2是5'race和3'race的pcr电泳图；a是5'race第一轮产物的凝胶电泳图，其中m：marker；1：pcr扩增产物；b是3'race第一轮产物的凝胶电泳图，其中m：marker；1：pcr扩增产物；c是5'race第二轮产物的凝胶电泳图，其中m：marker；1：pcr扩增产物；d是克隆gtpch2中间片段产物的凝胶电泳图，其中m：marker；1：pcr扩增产物；e是3'race第二轮产物的凝胶电泳图，其中m：marker；1：pcr扩增产物；

图3中a是带酶切位点gtpch2的pcr扩增凝胶电泳分析图，其中，m：marker；1、2：pcr扩增产物；b是pcr扩增产物的电泳鉴定图；c是重组质粒pet32a-gtpch2的酶切鉴定凝胶电泳分析图，其中，m：marker；1：pet32a-gtpch2bamhi和saci双酶切；2：pet32a-gtpch2未酶切；

图4中a是重组株pet32a-gtpch2-bl21表达产物gtpch2的sds-page电泳分析图，其中：m：蛋白marker；1：空载；2：未诱导菌液；3：重组株pet32a-gtpch2-bl21表达产物；4：纯化后的重组株pet32a-gtpch2-bl21表达产物；b是westernblot检测gtpch2抗血清鉴定图谱；其中，m：蛋白marker；1、2、3为gtpch2在纯红锦鲤的鳍条、鳞片、皮肤的表达；4、5、6为gtpch2在纯白锦鲤的鳍条、鳞片、皮肤的表达；c是重组锦鲤gtpch2的单克隆抗体ecl显色图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

gtpch2基因中间片段的克隆

对已报道的尼罗罗非鱼（oreochromisniloticus），剑尾鱼（xiphophorusmaculatus），秀美花鳉（poeciliaformosa），斑马鱼（daniorerio）中所获得的gtpch2序列进行比对，找到相对保守区域，设计克隆锦鲤gtpch2序列中间片段的一对简并引物，上游引物为5'ggcagaactgaacggtttgt3'，下游引物为5'ctccacgcatgaccatacac3'；以锦鲤总rna反转录后的cdna为模板做pcr。pcr条件为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，35个循环；72℃5min；4℃∞。pcr反应后的凝胶电泳图见图1。

实施例2

gtpch2基因5’race和3’race

根据已经获得的中间片段序列分别设计5'race和3'race各两条引物并利用通用引物upm-l和upm-s。

5'raceout引物为：

aap：5'acatcgtagatggtctcgtggtagc3'、

5'racein引物为：

r1：5'actgtcagctcgctaaagccgttac3'；

3'raceout引物为:

f1：5'gatggtctcgtggtagcctttggtc3'；

3'racein引物：

r15'caagcttactgaggccaacgacctt3'。

以锦鲤总rna反转录后的cdna为模板做pcr。pcr条件为：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min；4℃∞。pcr反应后的凝胶电泳图见图2中的a、b、c、d、e。

实施例3

gtpch2orf的克隆

根据实施例1和实施例2的结果，设计一对克隆gtpch2orf的引物，上游引物f-orf的核苷酸序列为5'atggaataccaaaaggcggcaga3'、下游引物r-orf的核苷酸序列为5'tcatcttctgcacgccacgcata3'，以锦鲤总rna反转录后的cdna为模板做pcr。pcr条件为：94℃3min；94℃30s，61℃30s，72℃2min，35个循环；72℃2min；12℃∞。经过pcr后把得到的产物与pmd-19载体连接在一起为pmd-19-gtpch2。pcr反应后的凝胶电泳图见图3中a。

实施例4

带酶切位点的斜带石斑鱼gtpch2基因合成

根据自己克隆到的锦鲤gtpch2基因的序列及限制性内切酶bamhi和saci的识别序列以及保护碱基，设计合成一对特异性引物，上游引物f为5'cgggatccgaggcgtacacaaccatcct3'是在gtpch2基因的成熟肽序列前添加了bamhi酶切识别位点和6×his标签，下游引物r为5'cgagctcaagcttactgaggccaacga3'是在gtpch2基因成熟肽序列后添加了保护碱基及saci酶切识别位点。利用自己构建的pmd-19-gtpch2为模板进行pcr反应，pcr反应条件为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，35个循环；72℃5min；12℃∞。pcr扩增产物的电泳鉴定图见图3中b。

实施例5

锦鲤gtpch2基因的大肠杆菌表达载体pet32a-gtpch2的构建

pcr产物用限制性内切酶bamhi和saci双酶切后，酶切产物用e.z.n.a.^®gelextractionkit回收，进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化锦鲤gtpch2基因片段；载体质粒pet32a经限制性内切酶bamhi和saci双酶切后分离纯化，与分离纯化斜带石斑鱼gtpch2基因片段混合，用t4连接酶16℃连接过夜后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌dh5a中，用lb平板筛选具ampicillin抗性的转化子，以标准方法提取质粒，用限制性内切酶bamhi和saci双酶切重组质粒，得到大和小两个片段，大小分别与锦鲤gtpch2基因和表达载体pet32a大小相同，证明锦鲤gtpch2基因已克隆入大肠杆菌表达载体pet32a中，重组质粒命名为pet32a-gtpch2。酶切分析图分别见图3中的c。

实施例6

能高效表达锦鲤gtpch2的大肠杆菌重组株pet32a-gtpch2-bl21的构建

制备好的重组质粒pet32a-gtpch2用热激法转入大肠杆菌bl21感受态细胞中，在含ampicillin的lb平板上37℃进行培养。过夜后长出单克隆，挑取单克隆经诱导培养与鉴定筛选出能高效表达锦鲤gtpch2的大肠杆菌重组株pet32a-gtpch2-bl21。

实施例7

利用大肠杆菌基因工程菌pet32a-gtpch2-bl21生产重组锦鲤gtpch2

挑取大肠杆菌工程菌pet32a-gtpch2-bl21单菌落接种在10mllb液体培养基中，37℃，200转/分培养过夜，然后按照1:100的比例接种于1llb液体培养基中，37℃，200转/分培养至od600到0.4-0.6，然后加入iptg使其终浓度为1mm，37℃，200转/分培养4小时后5000g离心10min收集菌体，超声破碎后12000g离心10min收集上清，经分离纯化得到重组锦鲤gtpch2蛋白。取3μl菌液加2×电泳上样缓冲液，煮沸10min后按标准方法跑sds-page凝胶电泳，同时取阴性对照按同样方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒pet32a转化bl21后长出的单克隆培养后的菌液。结果见图4中的a。pet32a-gtpch2-bl21表达破碎后上清用novagen公司的his-bindresin进行纯化处理，结果见图4中a。

将重组锦鲤gtpch2蛋白采用免疫印迹（westernblot）方法进行鉴定。一抗为鼠抗his单克隆抗体（购自novagen公司），二抗为羊抗鼠igg-hrp（购自索莱宝生物工程有限公司）。结果见图4中b。

实施例8

重组锦鲤gtpch2的单克隆抗体制备

锦鲤gtpch2抗血清的制备：将纯化的gtpch2融合蛋白和等体积弗氏完全佐剂充分混合后，每只小鼠皮下和腹腔注射融合蛋白300μg；初次免疫4周后加强免疫1次，接下来1周后眼球采血检测抗体效价。分离血清，分装后置-20℃保存。westernblot检测gtpch2抗血清：将锦鲤皮肤、鳍条、鳞片分别提取蛋白以25μg的蛋白量上样，经sds-page凝胶电泳后，并转膜，依次加入按1:100稀释的锦鲤gtpch2多克隆抗体及二抗hrp羊抗鼠igg，ecl显色后观察结果。结果见图4中c。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

序列表

<110>河南师范大学

<120>锦鲤gtpch2基因、编码蛋白及其应用

<130>2019

<141>2019-10-25

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>209

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metglutyrglnlysalaalagluleuasnglyleucysasnglylys

151015

ilevalthrglutyrleucysargasnglyphesergluleuthrval

202530

aspalalyslysvalalavalglnhislysasngluthrserarglys

354045

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505560

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65707580

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859095

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115120125

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

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210

<210>2

<211>630

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atggaataccaaaaggcggcagaactgaacggtttgtgcaatggcaaaattgtcacagag60

tatctctgccgtaacggctttagcgagctgacagtcgatgcgaagaaagtcgccgtacag120

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<210>3

<211>20

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>7

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

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