一种检测牛C型流感病毒的引物对、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物工程和分子检测技术领域，具体涉及一种检测牛c型流感病毒的引物对、试剂盒及其应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

流感病毒属于正黏病毒科的成员，是一种单链负义rna病毒。流感病毒依据序列差异和抗原性不同可以分为a、b、c、d四型。流感病毒对畜牧业和公共卫生安全均构成重要威胁，近百年来曾在全球引发四次流感大流行，对经济社会发展和公众健康造成严重危害。c型流感病毒作为流感病毒的一种，与a、b型流感病毒的基因组均由8个基因节段组成不同，c型流感病毒的基因组由7个基因组成，分别是pb2、pb1、p3、he、np、mp和ns组成，分别编码pb2、pb1、p3、he、np、m1、cm2、ns1和ns2九种病毒蛋白；其中he基因是c型流感病毒的抗原基因，编码病毒表面唯一的糖蛋白he蛋白，是区分c型流感病毒和d型流感病毒的关键基因。

a、b、c、d四型流感病毒均可以感染人。其中a型流感病毒和b型流感病毒是人类季节性流感病毒的主要成员，每年在全世界都会引发30万-50万人死亡，对公共卫生安全构成严重威胁，受到重点关注；研究表明，人季节性a型流感病毒最初是由动物流感病毒跨种传播而来，而后经过多次重配，目前形成h1n1和h3n2两种主要亚型。牛作为d型流感病毒的自然宿主，在d型流感病毒发现之前长期被研究者所忽略。然而目前研究发现，牛不但可以感染流感病毒，而且牛群中流感流行率较高，此外，研究者还发现了人感染牛流感病毒的血清学证据，这提示我们牛流感病毒存在跨种感染人和其它动物的风险，应加强对牛流感病毒的监测和研究工作。近年来的研究发现，除了d型流感病毒可以感染牛以外，原本只在人群中流行的c型流感病毒也在牛群中被分离到，提示牛c型流感病毒有跨种感染人的风险，对公共卫生安全构成潜在威胁。因此，加强对牛c型流感病毒的监测和研究工作可以做到关口前移，从流感病毒出现的源头兽群中及时发现有跨种传播威胁的牛c型流感病毒株，增强我们防控新发流感疫情的能力。

开展对牛c型流感病毒的监测，需要建立特异、灵敏、快速的检测方法，荧光定量pcr检测方法符合这一要求。由于牛c型流感病毒基因组序列与人牛c型流感病毒存在较大差异，直接使用人牛c型流感病毒荧光定量检测引物去检测牛c型流感病毒容易发生漏检，造成假阴性的情况出现，不利于牛c型流感病毒监测工作和研究工作的开展。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种检测牛c型流感病毒的引物对、试剂盒及其应用。本发明针对近年来新发现的牛c型流感病毒基因组来设计荧光定量检测引物；此外，考虑到d型流感病毒也可感染牛，而d型流感病毒的基因组组成又与牛c型流感病毒相同，因此在检测牛c型流感病毒时存在误检d型流感病毒的可能；因此本发明选择可以有效区分牛c型流感病毒和d型流感病毒的抗原基因he基因作为靶基因来设计荧光定量检测引物，从而获得一种特异性强、灵敏度高以及重复性好的检测牛c型流感病毒的荧光定量pcr引物对及相应试剂盒，从而完成本发明。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种引物对，所述引物对由引物f1和引物r1组成。

所述引物f1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；

所述引物r1为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子。

所述引物对的用途为如下(b1)或(b2)：

(b1)鉴定或辅助鉴定牛c型流感病毒；

(b2)鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有牛c型流感病毒。

本发明的第二个方面，提供所述引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)：

(b1)鉴定或辅助鉴定牛c型流感病毒；

(b2)鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有牛c型流感病毒。

本发明的第三个方面，提供一种试剂盒，包括上述引物对；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)：

(b1)鉴定或辅助鉴定牛c型流感病毒；

(b2)鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有牛c型流感病毒。

所述试剂盒还包括阳性标准质粒。具体来说，所述阳性标准质粒为将牛c型流感病毒的he基因(genbank登录号：mh348116.1)插入载体的多克隆位点得到的重组质粒。

本发明的第四个方面，提供一种鉴定或辅助鉴定牛c型流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cdna为模板，采用上述引物对进行荧光定量pcr；

如显示阳性扩增曲线、待测病毒为候选的牛c型流感病毒，如果不满足上述条件、待测病毒为候选的非牛c型流感病毒。

本发明的第五个方面，提供一种鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有牛c型流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的cdna为模板，采用上述引物对进行荧光定量pcr；

如果均显示阳性扩增曲线、待测样本疑似含有牛c型流感病毒，如果不满足上述条件、待测样本疑似不含有牛c型流感病毒。

以上任一所述方法中，荧光定量pcr的反应程序包括：预变性：95℃3min；pcr反应：95℃5s，60℃15s，40个循环；融解：95℃5s，60℃1min，95℃，1个循环。

以上任一所述方法中，荧光定量pcr的反应体系包括：2xtalentqpcrpremix(sybrgreen)10μl、引物f10.8μl、引物r10.8μl、cdna模板2μl，加rnase-freeddh2o至20μl。

以上任一所述方法中，荧光定量pcr采用sybrgreenⅰ染料。sybrgreenⅰ是一种结合于所有双链dna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，sybrgreenⅰ发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合，荧光强度大大增强。因此，可以根据荧光信号检测出pcr体系中存在的双链dna数量。虽然荧光定量pcr(染料法)为非特异性检测，但只要引物设计特异，排除非特异性扩增、引物二聚体等因素，并进行反应条件优化，在不需要探针条件下即可进行检测，省钱省时省力。

本发明的有益技术效果：采用本发明提供的引物对、试剂盒进行检测，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测，从而对对牛c型流感病毒进行快速的、高敏感度的实时荧光定量pcr检测；便于基层操作和应用，因此对于牛c型流感病毒疫病诊断和流行病学调查具有重大的应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1是pcr扩增idv基因组目的基因的片段的电泳图；

图2为实施例5的实时荧光定量pcr标准曲线图；

图3为实施例5的实时荧光定量pcr标准溶解曲线图；

图4为实施例6的实时荧光定量pcr特异性试验图，其中1为牛c型流感病毒he基因阳性质粒；2-5为牛d型流感病毒和a型流感病毒3个亚型(h1n1、h5n1和h9n2)。

图5为实施例7的实时荧光定量pcr的敏感性试验，其中1～8别为1.23×10⁷opies/ul～1.23×10⁰copies/ul；9阴性对照。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，直接使用人牛c型流感病毒荧光定量检测引物去检测牛c型流感病毒容易发生漏检，造成假阴性的情况出现，不利于牛c型流感病毒监测工作和研究工作的开展。且d型流感病毒也可感染牛，而d型流感病毒的基因组组成又与牛c型流感病毒相同，也不利于对牛c型流感病毒的检测。

有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种牛c型流感病毒荧光定量pcr引物对，包括he-2f-c：5'-agtagcttcagcctacacaat-3'，(seqidno.1)和he-2r-c：5'-tccaaagccaatccatgtact-3'，(seqidno.2)。上述引物根据genbank上已公布的牛c型流感病毒的he基因序列(genbank登录号：mh348116.1)为参考序列而设计。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的引物对可用于制备牛c型流感病毒荧光定量pcr检测试剂盒，从而对牛c型流感病毒进行病毒含量的检测。该试剂盒包括所述试剂盒由上述引物对、阳性标准质粒、2xtalentqpcrpremix(sybrgreen)实时荧光定量试剂和rnase-freeddh2o组成；所述阳性标准质粒是由序列由牛c型流感病毒的he基因(genbank登录号：mh348116.1)与载体相连后得到的重组质粒。

经试验证明，采用本发明的引物对制备的牛c型流感病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测，可对牛c型流感病毒进行快速的、高敏感度的实时荧光定量pcr检测。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1牛c型流感病毒he基因目的片段的常规pcr扩增

pcr反应体系为：金牌mix(green)24μl，上、下游引物各2μl(10μmol/l)，dna模板(模板质粒)2μl，总体积30μl。上述各组分混匀瞬时离心后，在pcr仪上执行以下程序：98℃预变性2min；98℃变性10s，52℃退火10s，72℃延伸20s；进行个40循环，最后取5μl反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。

实施例2阳性质粒的制备

根据qiaprepspinminiprepkit对阳性菌液进行少量提取和纯化后，于-20℃保存备用。

实施例3荧光定量pcr反应体系与反应条件的优化

以阳性重组质粒为模板，进行pcr扩增，对pcr反应体系(模板、2xtalentqpcrpremix、上下游引物、水)、反应条件(变性、退火、延伸的温度及循环次数)进行优化，选取ct最小值、荧光最高值、溶解曲线显示只有特异峰最佳的pcr反应条件。

反应体系：2xtalentqpcrpremix：10.0μl，1f：0.8μl，1r：0.8μl，cdna：2μl，rnase-freeddh2o：6.4μl，总体积20μl。预变性：95℃3min；pcr反应：95℃5s，60℃15s，40个循环；融解：95℃5s，60℃1min，95℃，1个循环，退火延伸时检测荧光信号。

实施例4重组质粒拷贝数计算以及标准品的制备

将上述质粒用核酸蛋白分析仪测定260nm与280nm波长下的od值，判断其纯度(od260nm/od280nm>1.8者为纯品)，然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数：拷贝数＝质粒浓度×10^-9×6.02×10²³/(660×质粒总长度)；其中重组质粒浓度为76ng/ul，总长度为5656bp。经计算拷贝数为1.23×10¹⁰拷贝/μl，将标准品作10倍梯度稀释，-20℃保存备用。

实施例5实时荧光荧光定量pcr反应及标准曲线和回归方程的建立

10倍梯度稀释阳性重组质粒，获得浓度为1.23×10⁷拷贝/μl～1.23×10⁰拷贝/μl的标准模板，采用优化好的条件进行pcr扩增，扩增结果使用480ii中genescanningsoftwareversion1.5软件的absquant/2ndderivativemax分析模式分析，结果各点在一直线上，采用最大二阶导数法(以ct值作为纵坐标，以起始模板浓度的对数作为横坐标)制作一条标准曲线。得出拷贝数的对数值与ct值之间的线性关系表达式y＝-3.7591x+35.766，r²＝0.9978，不同浓度的标准品之间具有良好的线性关系。其中x轴为质粒标准品拷贝数的对数值，y轴为循环阂值，结果如图2所示。如图3所示，标准样品均出现了单一波峰，而阴性对照没有出现熔点峰，表明该实验中未出现污染、引物二聚体，sybrgreen实时荧光定量pcr反应为特异性扩增。

实施例6特异性实验

采用建立好的实时荧光定量pcr方法以牛d型流感病毒、a型流感病毒3个亚型(h1n1、h5n1和h9n2)、ddh2o为模板进行pcr检测，检测结果均为阴性，而牛c型流感病毒he基因有良好的扩增，结果表明此次设计的引物只能特异性扩增牛c型流感病毒的he基因，其他样品和阴性对照均无特异性扩增(见图4)，说明所建立的实时荧光定量pcr方法具有很好的特异性。

实施例7敏感性实验

将标准阳性质粒作10倍倍比稀释，直至无荧光信号出现，该sybrgreeni荧光定量pcr方法所能检出的最低模板拷贝数为1.23×10⁰拷贝/μl(见图5)。把检测结果与常规pcr检测方法进行比较，常规pcr最佳反应条件为98℃预变性2min；98℃变性10s，52℃退火10s，72℃延伸40s；进行个40循环，常规pcr所能检出的最低模板拷贝数为1.23×10²拷贝/μl，结果表明荧光定量pcr灵敏度比常规pcr高100倍，本试验建立的检测方法敏感性均比普通pcr高，检测结果更可靠。

实施例8重复性实验

选取质粒浓度为1.23×10⁴拷贝/μl～1.23×10¹拷贝/μl的标准品分别做3个批内重复和批间重复，实时荧光定量pcr方法优化的最佳反应条件进行扩增，批内重复变异系数均小于0.7，批间重复变异系数均小于1.9(见表1)，,结果表明该实时荧光定量pcr检测方法具有良好的重复性和稳定性。

表1实时荧光定量pcr批内与批间重复性试验

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

sequencelisting

<110>山东省农业科学院家禽研究所

<120>一种检测牛c型流感病毒的引物对、试剂盒及其应用

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