脐带间充质干细胞的分离纯化方法与流程

本发明涉及干细胞与再生医学技术领域，特别是涉及一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法。

背景技术：

间充质干细胞(msc)是一类来源于中胚层的具有高度自我更新和多向分化能力的多能干细胞，可以在体外培养扩增并在特定条件下具有多向分化能力，可以分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、肝脏细胞，甚至还可以横向分化为神经细胞、表皮细胞等，msc具有广阔的临床应用前景，是再生医学和组织工程领域中最重要的种子细胞。间充质干细胞最早被发现于骨髓组织中，随着研究的深入，在人体多种组织中也相继被发现，如骨髓、脂肪、脐带、胎盘等。

脐带组织属于胎盘组织，是包裹胎儿和羊水的一层半透明膜，胎儿出生后随胎盘一起排出母体，属于孕妇产后的废弃物。脐带组织中无血管、神经和淋巴管分布，具有一定的弹性，厚度在0.02-0.5mm之间，在电子显微镜下，脐带组织横截面由外到内可以分为5层：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层，其中上皮层主要由脐带上皮细胞构成，脐带间充质干细胞存在于致密层等皮下层中。

脐带间充质干细胞(mesenchymalstemcells,mscs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。脐带间充质干细胞(mscs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨，软骨，肌肉，肌腱，韧带，神经，肝，内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。

然而，传统的人脐带间充质干细胞分离方法上存在效率低时间长的问题。原代脐带间充质干细胞的最常见分离方法包括酶消化法和组织块培养法。酶消化培养法的经济成本高，一般4～5h，一般使用胶原酶进行消化，但消化程度不易把控，如消化不够，无法得到足够数量的细胞，但消化时间过久，使用的酶对细胞的损伤又太大，细胞会大量死亡。且由于消化液为黏稠液体，离心时不易分离出细胞，因此酶消化法的效果不稳定。虽然，组织块培养法过程简便易行，且经济成本低，但原代培养时间太长，通常需要14～20d才能够得到数量不多的原代细胞。本发明主要通过改良消化酶的配方以及把酶消化法与组织培养法相结合，同时提高稳定性和细胞提取效率。

技术实现要素：

基于此，有必要针对上述问题，提供一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法，

一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：

分离脐带组织：取脐带组织，清洗去除血液，剪碎为组织碎片，备用；

组织消化：取上述组织碎片，加入组织消化液震荡消化；所述组织消化液中含有中性蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶ii和dna酶；消化结束后加入终止液终止，过滤，得未消化的组织块和滤液，将滤液离心去除上清获得细胞；

细胞培养：将上述组织块和细胞接种于培养瓶中，以无血清培养基进行培养，获得所述脐带间充质干细胞。

上述脐带间充质干细胞的分离纯化方法，针对常规技术中酶消化法和组织块培养法的不足，通过调整消化酶的配方，可分离大部分出脐带间充质干细胞，同时回收部分消化组织后的脐带组织与分离出的细胞一同培养，能够在三至五天内得到足够的原代细胞。

具体的，同时采用中性蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶ii和dna酶来消化脐带组织可以在短时间内获得比较多的脐带细胞。同时将未消化完全的组织与细胞共培养可以提高细胞的获取率和稳定性，该方法同时具有酶消化法的高效性和组织培养法的稳定性。

在其中一个实施例中，所述组织消化液包括：0.9％的nacl，1.5-2.5mg/ml的中性蛋白酶，1.5-2.5mg/ml的透明质酸酶，1.5-2.5mg/ml的胶原酶ii和1.5-2.5mg/ml的dna酶。采用该组织消化液，能够快速消化获得脐带间充质干细胞，并且不会损伤细胞活性，具有较好的繁殖能力。

在其中一个实施例中，所述组织消化液的加入量为1.5±0.5ml组织消化液/1g脐带组织。

在其中一个实施例中，组织消化步骤中，在37±2℃，200±30rpm震荡消化1-2h。

在其中一个实施例中，所述无血清培养基由无血清间充质干细胞培养基、5-15ng/ml的bfgf和2.5-7.5ng/ml的hgf组成。采用上述培养及配方，具有使细胞生长状态优化的优点。

在其中一个实施例中，所述细胞培养步骤中，当原代培养5-8天达到融合度75-85％进行传代培养，随后每3天传代一次，传代2-3代。

间充质干细胞是具有成纤维细胞特性的细胞，在成纤维细胞生长因子的刺激下可以快速增殖，通过扩大脐带间充质干细胞和脐带上皮的增殖速度来使脐带间充质干细胞活到生长优势，经过2-3次传代培养后可以得到高纯度的脐带间充质干细胞，相比现有的分离纯化方法更简单有效，而且对细胞活性无任何影响，有利于脐带间充质干细胞扩增及后期临床应用。

在其中一个实施例中，所述细胞培养步骤中，传代时的传代比例为1:3-5。即以原来细胞20％-33％进行传代，以该比例进行传代，具有使细胞生长状态较好的优点。

在其中一个实施例中，所述细胞培养步骤中，检测传代培养得到的脐带间充质干细胞表面标记物，待cd73、cd90、cd105阳性率均≥95％，cd34、cd45阳性率均≤5％，停止传代，收获细胞，即得。当检测到上述指标，证明间充质干细胞纯度符合要求。

在其中一个实施例中，所述分离脐带组织步骤之前，还包括脐带组织采集步骤，所述脐带组织采集步骤为：取胎盘组织，在组织保护液存在条件下0-4℃保存和/或运输。

在其中一个实施例中，所述组织保护液包括：生理盐水，20-30μg/ml的硫酸庆大霉素和2.5-7.5μg/ml的两性霉素b。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法，针对常规技术中酶消化法和组织块培养法的不足，通过调整消化酶的配方，可分离大部分出脐带间充质干细胞，同时回收部分消化组织后的脐带组织与分离出的细胞一同培养，能够在三至五天内得到足够的原代细胞。

上述组织消化液中，，同时采用中性蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶ii和dna酶来消化脐带组织可以在短时间内获得比较多的脐带细胞。同时将未消化完全的组织与细胞共培养可以提高细胞的获取率和稳定性，该方法同时具有酶消化法的高效性和组织培养法的稳定性。

并且，本发明还对其中各步骤所选用的条件和参数进行了优选，得到能够快速高效分离培养纯化脐带间充质干细胞的方法，相比现有的分离纯化方法更简单有效，而且对细胞活性无任何影响，有利于脐带间充质干细胞扩增及后期临床应用。

附图说明

图1为实施例1中原代培养细胞生长曲线图；

图2为实施例1中显微镜下(×20倍)观察培养所得脐带间充质干细胞；

图3为实施例2中原代培养细胞生长曲线图；

图4为实施例3中原代培养细胞生长曲线图；

图5为对比例1中原代培养细胞生长曲线图；

图6为对比例1中显微镜下(×20倍)观察培养所得脐带间充质干细胞；

图7为对比例2中原代培养细胞生长曲线图；

图8为对比例2中显微镜下(×20倍)观察培养所得脐带间充质干细胞；

图9为对比例3中原代培养细胞生长曲线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下酶来源和活力单位为：

中性蛋白酶：sigma-1g≥0.5units/mg；

透明质酸酶：sigma-1gampuleof300×units；

胶原酶ii：sigma-1g0.5-5.0falgpaunits/mg；

dna酶：sigma-1g≥400kunitzunits/mg；

胰蛋白酶：gibco-500ml0.25％。

实施例1

一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：

一、脐带组织采集。

医院采集足月剖腹产胎儿胎盘组织，采集前签署客户知情同意书，组织于4℃冷藏无菌环境下运抵实验室，运输过程中使用组织保护液保护胎盘组织生物学活性，组织保护液由生理盐水添加25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素b配制，确保运输过程中无细菌和真菌污染。

二、分离脐带组织。

1，清洁、分离。

无菌实验室中分离脐带组织，预冷的组织清洗液清洗脐带组织2-3次，将组织上粘黏的血迹清洗干净，使脐带组织呈半透明状，组织清洗液由生理盐水添加25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素b配制。

2，剪碎。

将脐带组织剪成约2-3mm的小块组织，得组织碎片。

三、组织消化。

1，消化。

取上述组织碎片，按照1g组织碎片加入1.5ml组织消化液，于37℃,200rpm震荡消1-2h。

组织消化液配方如下：生理盐水+中性蛋白酶(2mg/ml)+透明质酸酶(2mg/ml)+胶原酶ii(2mg/ml)+dna酶(2mg/ml)。

2，终止消化。

加入与组织消化液等体积的终止液终止消化，过100μm滤网，收集未消化完全的组织块，备用。上述终止液为完全培养基。

3，收集细胞沉淀。

同时收集滤液(即细胞悬液)，离心(转速：1000r/min，时间：5分钟)，去除上清液，加入40mldmem清洗沉淀，再次离心(转速：1000r/min，时间：5分钟)，收集细胞沉淀。

四、细胞培养。

1，接种。

将上述未消化完全的组织块提前种在培养瓶中，并加入上述收集得到的细胞沉淀。并以间充质干细胞选择培养基将沉淀种在含有组织的培养瓶中进行正常培养。

所用的选择性培养基配方：

无血清培养基：间充质干细胞无血清培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，产品货号：nc0103)

bfgf：10ng/ml

hgf：5ng/ml。

2，培养。

原代培养的细胞生长曲线如图1所示，图中纵坐标表示细胞数量，从图中可以看出，细胞从能迅速进入对数生长期。

原代培养5-8天达到融合度80％进行传代培养，其后每3天传代一次，传代比例为1:4。

3，检测。

取p3的脐带间充质干细胞做表面标记物分析，检测cd73、cd90、cd105、cd34、cd45，其结果为cd73、cd90、cd105阳性率≥95％，cd34、cd45阳性率≤5％，证明间充质干细胞纯度符合要求。

并同时在镜下观察培养所得脐带间充质干细胞，如图2所示，从图中可以看出，细胞形态良好。

实施例2

一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于，组织消化液中中性蛋白酶的含量为1.5mg/ml。

其中，原代培养的细胞生长曲线如图3所示，从图中可以看出，细胞进入对数生长期的时间较实施例1长。

实施例3

一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于，组织消化液中中性蛋白酶的含量为2.5mg/ml。

其中，原代培养的细胞生长曲线如图4所示，从图中可以看出，细胞进入对数生长期的时间较实施例1长。

对比例1

一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于，组织消化液中未添加中性蛋白酶。

其中，原代培养的细胞生长曲线如图5所示，从图中可以看出，细胞生长的速率偏慢。

并同时在镜下观察培养所得脐带间充质干细胞，如图6所示，从图中可以看出，细胞形态细胞较实例1体积大，表明状态不如实施例1的细胞生长状态。

对比例2

一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法，为传统组织贴壁法培养。

其中，原代培养的细胞生长曲线如图7所示，从图中可以看出，细胞数量增长较慢。

并同时在镜下观察培养所得脐带间充质干细胞，如图8所示，从图中可以看出，细胞形态有贴壁不牢的现象。

对比例3

一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于，将组织消化液中的中性蛋白酶替换为胰蛋白酶。

其中，原代培养的细胞生长曲线如图9所示，从图中可以看出，细胞生长速率较慢。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。