一种原核表达的CD20核酸适配体、筛选方法及其应用与流程

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种与原核表达的cd20蛋白膜外区特异性结合的核酸适配体、筛选方法及其应用。

背景技术：

分化簇20蛋白(cd20)是b细胞特异性膜蛋白，cd20膜蛋白有279个氨基酸残基，以非糖基化形式存在，其分子量因磷酸化程度不同而不同，范围为33-35kda。cd20在早期b淋巴细胞和成熟的b淋巴细胞中都有所表达，但当其分化为浆细胞时，其表达停止。cd20蛋白膜外区是几种单克隆抗体的靶标，如利妥昔单抗、奥法木单抗、阿托珠单抗、替伊莫单抗和托西莫单抗，用于临床治疗cd20阳性非霍奇金淋巴瘤(nhl)和慢性淋巴细胞白血病(cll)。尽管利妥昔单抗取得了临床成功，但复发仍然很常见。因为抗cd20抗体具有多种效应功能，其中包括促进靶细胞中的补体依赖性细胞毒性，补体激活导致外来病原体或正常组织的快速和高度破坏，导致移植后的自身免疫疾病，如类风湿性关节炎，狼疮和移植排斥反应。为了进一步提高b细胞淋巴瘤药物的疗效，急需建立一种准确可靠、灵敏快速、广泛适用的特异性识别cd20蛋白的方法。

cd20蛋白是真核细胞的膜蛋白，为了大量获得cd20蛋白膜外区结构，急需选择一种高效的表达系统。而原核表达系统能够获得高水平的基因表达产物，并且目的蛋白纯化方法便捷，适用于表达cd20蛋白膜外区。

selex(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)是一个典型的多学科程序，涉及不同领域，如分子生物学，核酸化学，材料科学和针对各种目标的亲和配体的生物信息学。适配体，基于核酸的配体，是小的单链dna或rna寡核苷酸，通过称为指数富集配体系统进化(selex)的过程在体外产生。与蛋白质抗体相比，寡核苷酸适配体具有以下显着优势：组织通透性更高、便于修饰，成本低、性质稳定。适配体与其靶分子如此紧密结合的能力是其复杂的三维结构的结果，与单克隆抗体类似，适配体通过范德华力、氢键和静电相互作用折叠成分子结构(g四联体，凸起环，假结，发夹等)与靶标结合。类似的结合机制使适配体具有与抗体相同的预期功能，促进它们在一系列药理学领域中的应用，例如药物发现，医学诊断和作为药物递送载体。cd20蛋白特异性核酸适配体对于cd20蛋白检测，进而提高b细胞淋巴瘤的治愈率具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提出了原核表达的cd20核酸适配体、筛选方法及其在cd20蛋白和b淋巴瘤检测中的应用，以解决现有技术中体外识别结合检测b细胞淋巴瘤可行性低、特异性差的问题。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的是提出一种原核表达的cd20核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列为seqidno.1-23所示的任一条dna片段的核苷酸序列，所述核酸适配体与原核表达的cd20蛋白膜外区特异性结合。

进一步地，所述适配体的两端任选地进行氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰，经修饰后的核酸适配体分子，同样具有与cd20表位肽以及cd20阳性的肿瘤细胞相结合的功能。

本发明的第二个目的是提供筛选上述的原核表达的cd20核酸适配体的方法，包括如下步骤：

(1)提供随机单链dna文库，所述dna文库包括由下式表示的随机单链dna：5’taccggtccgagtcactg-n40-ccgtgtgagctctagacgttga3’，其中n40表示中间为40bp随机序列；并且提供seqidno.25和seqidno.26所示的一对引物；

(2)随机单链dna文库变性后依次经cd20-gst蛋白正筛、gst蛋白反筛获得第一轮筛选产物；

(3)以步骤(1)所述引物对第一轮筛选产物进行不对称pcr扩增，获得第二轮核酸适配体文库；

(4)依次类推，由上一轮核酸适配体文库经变性、cd20-gst蛋白正筛、gst蛋白反筛获得上一轮筛选产物，然后以步骤(1)所述引物对上一轮筛选产物进行不对称pcr扩增获得下一轮核酸适配体文库；共筛选9轮，最终获得原核表达的cd20蛋白膜外区核酸适配体；

每轮筛选中所述cd20蛋白膜外区核酸序列进行密码子偏好性改造，改造后cd20蛋白膜外区核酸序列如seqidno.24所示。

进一步地，所述随机单链dna文库与cd20-gst-glutathionesepharose4fastflow孵育的时间为15min。

进一步地，所述pcr扩增条件为：95℃5min；94℃30sec，50℃30sec，72℃30sec，22次循环后延伸；72℃7min。

本发明的第三个目的是提供如上述任一所述的原核表达的cd20核酸适配体在制备用于检测人cd20蛋白的试剂中的用途。

本发明的第四个目的是提供上述任一所述的原核表达的cd20核酸适配体在制备用于检测和/或治疗b细胞淋巴瘤制剂中的用途。

因此，与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明通过对cd20蛋白膜外区核酸密码子偏好性进行改造，在原核中大量表达cd20蛋白膜外区结构，在筛选适配体时，以原核表达的cd20-gst蛋白作为正筛物质，gst蛋白作为反筛选物质，筛选得到与原核表达的cd20蛋白膜外区特异性结合的核酸适配体sw1-sw23(核苷酸序列为seqidno.1-23所示)，该核酸适配体是单链dna，由80个核苷酸组成。基于病理切片和流式细胞术进行核酸适配体特异性、亲和力评估，显示本发明的适配体能特异性与cd20蛋白膜外区结合，因此该核酸适配体针对cd20蛋白具有高特异性的特点，可用于后续对cd20蛋白的快速检测和b细胞淋巴瘤的检测。

附图说明

图1是bio标记实施例1提供的核酸适配体seqidno.9和seqidno.11免疫组织化学染色图片。图1a、图1b、图1c分别为乳腺癌组织的he染色对照、bio-seqidno.9和bio-seqidno.11染色结果(10×)；图1d、图1e、图1f分别为肺癌组织的he染色对照、bio-seqidno.9和bio-seqidno.11染色结果(40×)；图1g、图1h、图1j分别为淋巴瘤组织的he染色对照、bio-seqidno.9和bio-seqidno.11染色结果(40×)。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、原核表达的cd20蛋白膜外区核酸适配体的筛选

一、原核表达的cd20蛋白膜外区

1、cd20蛋白膜外区核酸序列进行密码子偏好性改造

cd20蛋白膜外区核酸序列为：attaaaatttcccattttttaaaaatggagagtctgaattttattagagctcacacaccatatattaacatatacaactgtgaaccagctaatccctctgagaaaaactccccatctacccaatactgttac，改造后核酸序列如seqidno.24所示。

2、重组质粒pgex-4t-cd20的构建

2.1以改造后的dna为模板，进行目的基因pcr扩增，pcr反应体系如下：

表1

反应条件：

a.95℃，5min

b.94℃，30sec；55℃，1min；72℃，15s；25个循环

c.72℃，7min

2.2用3％琼脂糖凝胶电泳，回收分子量大小为132bp的pcr产物。

2.3以bamhi和xhoi为限制性内切酶，对质粒载体pgex-4t-1进行酶切：

表2酶切反应体系

酶切反应条件为：37℃水浴4小时。

2.4回收酶切反应产物中分子量大小为4.9kb的pgex-4t-1的目的片断。

2.5连接反应体系：

表3

连接反应条件为：16℃孵育4小时。

2.6制备大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。

2.7大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞转化

(1)从低温冰箱中取出已制备好的感受态细胞，冰浴15分钟。

(2)待感受态细胞刚开始融化时，加入连接产物10μl，轻轻混匀，冰浴30分钟。

(3)将ep管放入42℃水浴90秒，勿震荡。

(4)冰浴5分钟。

(5)加入700μllb液体培养基，37℃低速震荡45分钟。

(6)产物涂在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的无菌lb平板上37℃，16小时。

(7)挑取单个克隆，加入到3ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的lb中，37℃，16小时。

(8)提取质粒dna。

(9)酶切鉴定克隆，方法同上，所用限制性内切酶为bamhi和xhoi。

(10)将鉴定正确的14个克隆送至上海生工公司测序。

3、pgex-4t-cd20的原核表达和纯化

3.1挑取含有pgex-4t-cd20(cd20-gst融合蛋白的原核表达载体)的大肠杆菌bl21(de3)于3ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的lb培养基中，对照组接种含有pgex-4t-1(gst蛋白的原核表达载体)的大肠杆菌bl21(de3)，37℃培养12～16小时。

3.2将小试管中的菌液分别转移到200ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃培养到od600为0.6～0.8。

3.3加入100mmiptg，使其终浓度为0.1mm，16℃诱导20小时。

3.4将诱导以后的菌液分装到500ml的离心管中，4℃，8000rpm，离心5min，弃上清。

3.5沉淀用pbs洗涤3次，4℃，8000rpm，离心5min，弃上清。

3.6将沉淀重悬于8ml含1mmpmsf的pbs中。

3.7将菌液放置冰中，超声碎菌。

3.8每ep管中加入1ml超声降解的菌液，4℃，12000rpm，离心15min，取上清。

3.9各ep管加入20μl50％glutathione-sepharose4fastflow，室温轻混1h。

3.104℃，500g，离心5min，弃上清。

3.11每个ep管各加入100μl0.01mpbs洗涤，洗涤后将含有glutathione-sepharose4fastflow的悬浊液收集于一管，4℃，500g，离心5min，弃上清，共洗涤3次。

3.12加入与glutathione-sepharose4fastflow等量的1mm还原性谷胱甘肽(gsh)，室温轻混10min。4℃，500g，离心5min，取上清。

3.13重复12步骤2次。

3.14收集的上清则为所需蛋白。

4、原核表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测

4.1安装玻璃板。

4.2配制分离胶溶液，一旦加入temed，马上快速旋动混合物。

4.3迅速在玻璃板间隙中注入分离胶溶液，小心在溶液上覆盖一层水压平胶溶液。

4.4待分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，尽可能排去未聚合的丙烯酰胺及胶上面的液体，用滤纸吸净残留液体。

4.5制备浓缩胶，并加入到已聚合的分离胶上，立即在其中插入干净的梳子，将凝胶放置聚合。

4.6将样品加入等量的2×sds凝胶加样缓冲液，在100℃加热10分钟以使蛋白质变性。

4.7浓缩胶聚合完全以后，小心移出梳子，将凝胶固定于电泳装置上，电泳槽加入1×sds电泳缓冲液。

4.8按照预定顺序加样，每样品加20μl。

4.9将电泳装置与电源相接，加电压100v，当染料前沿进入分离胶时，把电压提高到120v，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶底部后，关闭电源。

4.10从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。

4.11用考马斯亮蓝染色，放在水平摇床上于室温染色4小时以上。

4.12移出并回收染液以备后用，将凝胶浸泡于脱色液中，平缓摇动2～3小时，期间更换脱色液2～3次。

4.13脱色后，将胶用凝胶成像仪成像，并保存结果。

5、pgex-4t-cd20原核表达产物的免疫印迹(westernblot)鉴定

5.1戴手套，剪裁6张滤纸和聚偏氟乙烯膜(pvdf膜)，大小与凝胶大小吻合。

5.2pvdf膜先用无水甲醇激活15s，然后浸泡于一盘去离子水上，借毛细作用使之从下往上湿润后，浸泡于水中，大约5分钟以上以驱除残留于滤膜上的气泡。

5.3在一个浅托盘中加入少量的转移缓冲液，将6张滤纸浸泡其中。

5.4戴上手套，按照以下方法安装转移装置：

(1)平放底部电极(+)，石墨一边在下。

(2)在这一电极上放置3张用转移缓冲液浸泡过的3mm滤纸，逐张叠放，精确对齐，然后用一个玻璃移液管作滚筒以挤出所有气泡。

(3)pvdf膜放在3mm滤纸上。

(4)凝胶转移到一盘去离子水中，漂洗一下，放于pvdf膜上。

(5)再放上3张3mm的滤纸。

(6)连接电源(将阳极导线或者红色导线接于石磨电极)，300ma，90min。

(7)将pvdf膜从转印夹中取出，浸入封闭液中，室温封闭1小时。

(8)加入一抗(为兔抗gst抗体1：1000)，室温下孵育2小时，洗膜4次，每次15min。

(9)加入二抗(hrp标记的羊抗鼠抗体1：5000)，将pvdf膜放入其中，室温下孵育1小时，洗膜4次，每次15min。

(10)用邻苯二胺底物显色，轻轻摇动pvdf膜。

(11)用凝胶扫描分析系统扫描pvdf膜，分析结果。结果表明，所表达的cd20-gst融合蛋白能够特异性与gst蛋白抗体结合，说明cd20蛋白膜外区以一种融合蛋白形式在大肠杆菌中表达。

二、单链dna随机文库的构建和扩增

随机核酸适配体文库为：5’-taccggtccgagtcactg-n40-ccgtgtgagctctagacgttga-3’(80nt)，其中5’端固定核酸序列18bp，3’固定核酸序列22bp，中间为40bp随机序列，n代表a、c、t或g。

上游引物核苷酸序列如seqidno.25所示，下游引物核苷酸序列如seqidno.26所示。

seqidno.25：5’-taccggtccgagtcactg-3’

seqidno.26：5’-tcaacgtctagagctcacacgg-3’

将得到的dna进行不对称pcr，反应体系如下：

表4

反应条件：

a.95℃，5min

b.94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，10s；22个循环

c.72℃，7min

三、筛选原核表达的cd20蛋白膜外区的单链dna适配子

采用合成的单链dna文库，以cd20-gst-glutathionesepharose4fastflow作为正筛选介质，gst-glutathionesepharose4fastflow作为反筛选介质，采用selex技术筛选cd20蛋白膜外区特异性核酸适配体。具体步骤为：

1.合成并纯化dna随机文库。

2.取cd20-gst-glutathionesepharose4fastflow适量(蛋白量大于0.2mg)，用筛选缓冲液反复洗涤。

3.将合成纯化的200-500pmol的dna随机文库稀释于500μl的筛选缓冲液中，85℃，10min孵育后立即置于冰上10mim，随后加入到cd20-gst-glutathionesepharose4fastflow中，室温下轻振15分钟。

4.离心(5000rpm，5min)。

5.弃上清，再加入500μl筛选缓冲液，于85℃变性10min。

6.离心(5000rpm，5min)，取上清，将与cd20-gst-glutathionesepharose4fastflow结合的dna随机适配体文库置于85℃孵育10min，然后立即置于冰上10min。

7.将gst-glutathionesepharose4fastflow取适量(蛋白量大于0.2mg)，用筛选缓冲液反复洗涤。

8.加入已经处理好的、与cd20-gst-glutathionesepharose4fastflow结合的dna随机适配体文库，室温下轻振15分钟。

9.离心，5000rpm，5min，取上清。

10.纯化dna上清液，获得第一轮筛选产物。

11.以seqidno.25、seqidno.26为引物对第一轮筛选出的核酸文库进行不对称pcr扩增，作为第二轮核酸适配体筛选文库。

12.以上一轮筛选产物为模板进行不对称pcr扩增，重复步骤2-10进行下一轮筛选，共筛选9轮，将所得产物连接到pmd-18t，经克隆测序分析，最终得到seqidno.1-23所示的核酸适配体。其序列见表5。

表5cd20蛋白膜外区特异性核酸适配体sw1-sw23序列

用mfold软件对本实施例23个适配体对应的序列进行二级结构模拟，综合这些二级结构的结构特点，发现它们富含环状结构和茎状结构，这些二级结构在与靶标结合的过程中发挥重要作用。

实施例2、核酸适配体sw1-sw23的特异性、亲和力

一、核酸适配体sw1-sw23特异性检测

1.取乳腺癌、肺癌、b细胞淋巴瘤患者的肿瘤组织制作病理切片。

2.切片常规脱蜡至水(二甲苯20min，二甲苯20min，无水乙醇10min，95％乙醇10min，90％乙醇10min，85％乙醇10min)。

3.30％h2o21份+蒸馏水10份混合，室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。

4.热修复抗原：将切片浸入0.01m枸橼酸盐缓冲液(ph6.0)，电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10分钟后，反复1-2次。冷却后pbs(ph7.2-7.6)洗涤1-2次。

5.滴加5％bsa封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，不洗。

6.滴加适当稀释的生物素化适配体，37℃1小时。pbs(ph7.2-7.6)洗2分钟×3次。

7.滴加免疫组化试剂盒中试剂sabc，37℃20分钟。pbs(ph7.2-7.6)洗5分钟×4次。

8.dab显色：使用dab显色试剂盒。取1ml蒸馏水，加试剂盒中a，b，c试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5-30分钟之间。也可自配显色剂显色。蒸馏水洗涤。

选取本发明实施例中单适配体seqidno.9、seqidno.11分别测定cd20蛋白膜外区结合特异性。在特异性检测中，seqidno.9和seqidno.11虽然都能特异性与乳腺癌、肺癌、淋巴瘤组织结合，但是相较于乳腺癌、肺癌组织，seqidno.9和seqidno.11与b细胞淋巴瘤组织有最强的的结合能力，并且与b细胞淋巴瘤组织结合能力显著高于与乳腺癌、肺癌组织的结合能力(见图1)。

二、流式细胞仪测定适配体的亲和力

选取本发明实施例中单适配体seqidno.1-23分别测定解离常数。先用fitc标记的引物扩增出相应的单适配体，然后将带有荧光标记的单适配体分别与raji细胞作用。用流式细胞仪检测各轮fitc标记的单适配体与raji细胞结合的荧光强度。实验重复三次，计算测得的数据，根据下列公式计算解离常数kd值。

y＝bmaxx/(kd+x)

其中y代表平均荧光强度；bmax代表所测得的最大荧光强度；kd为解离常数；x为所加的单适配体的浓度。

解离常数kd的测定可以表明适配体与raji细胞的的结合能力。经检测，所获得的的适配子解离常数在28-169nm之间，显示出与raji细胞有较好的结合能力。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖北大学

<120>一种原核表达的cd20核酸适配体、筛选方法及其应用

<160>26

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

taccggtccgagtcactgcatcgcagtgacgacgtgattgagaaaacgcaccgacgcacc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>2

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

taccggtccgagtcactggtcgctacaccatacgacgggcgccagataaccaagaatgcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>3

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

taccggtccgagtcactgcacaagcagtgacgaattccgacgcctgacaggtcttatgcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>4

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

taccggtccgagtcactgcgaggatccggtgtggtccgtccgttggaagaactttgcccc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>5

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

taccggtccgagtcactggtcgctagaccatgcgacggccgctagataatcaagaatgcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>6

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

taccggtccgagtcactgcacaagcagtgacgctggttcctggtcatgaggggtcaggcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>7

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

taccggtccgagtcactgcgcaagcagtgacgaattccgacgcctgacaggtcttatgcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>8

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

taccggtccgagtcactggggacgaggagcggggatcaacataacaagcgattgatagcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>9

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

taccggtccgagtcactgcatcgcagtgacgcagcagactccccatccattcggacttcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>10

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

taccggtccgagtcactggggcctagtggcgagggccggtttgggtcataacatggaacc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>11

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

taccggtccgagtcactggggacgaggagcggggatcaacataacaagcaattgatagcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>12

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

taccggtccgagtcactgggcgaggagcggtcggtcggtgataatcttaatatcatggcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>13

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

taccggtccgagtcactgcgcaagcagtgacgaattccgacgcctgacaggccttatgcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>14

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

taccggtccgagtcactgcaccgcagtgacgcagcagactccccatccattcggacttcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>15

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

taccggtccgagtcactgcacaagcagtgacgctggttcctggtcatgaggggtcaggcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>16

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

taccggtccgagtcactgggacgaggaaaccggtccgtacatcatattctccagtttgcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>17

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

taccggtccgagtcactgggggacgaggtccgccaagtgtacactctgatagctaacgcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>18

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

taccggtccgagtcactgggggacgaaggacgggggcagctctcctgatataaatggtcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>19

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

taccggtccgagtcactggtcgctagaccatacgacggccgctagataaccaagaatgcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>20

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

taccggtccgagtcactggggacgaggagcgggggtcaacataacaagcaattgatagcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>21

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>21

taccggtccgagtcactgcgcaagcagtgacgctggttcctggtcatgaggggtcaggcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>22

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>22

taccggtccgagtcactgcgcaagcagtggcgaattccgacgcttgacaggtcttatgcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>23

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>23

taccggtccgagtcactgggcgtcgacccagtgcgaggcagtcaattgtttcagcattcc60

gtgtgagctctagacgttga80

<210>24

<211>132

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>24

atcaagatcagccattttctgaaaatggaaagtctgaatttcatccgcgcacataccccg60

tatattaatatctataattgcgaaccggccaatccgagcgaaaagaatagtccgagtacc120

cagtattgctat132

<210>25

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>25

taccggtccgagtcactg18

<210>26

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>26

tcaacgtctagagctcacacgg22