梨PbELF3b基因的特异性分子标记及其应用的制作方法

文档序号：19539517发布日期：2019-12-27 16:17阅读：369来源：国知局

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种梨花芽分化发育的分子标记及其应用。本发明的分子标记来源于pbelf3b基因。本发明公开了分别从砂梨和新疆梨中分离克隆的pbelf3b等位基因n型和d型及改造后的n-d型和d+d型。d型相对n型缺失一段大小为58bp的d片段。这一片段的缺失可以导致pbelf3b基因具有更强的延迟开花活性。

背景技术：

中国是梨属植物的起源中心，也是世界栽培梨的多样性中心之一。梨树在中国分布广泛，栽培面积大产量高。近些年，在传统主栽品种基础上，相继培育出‘翠冠’、‘玉露香’等为代表的优良品种。‘翠冠’是由浙江省农业科学院园艺研究所育成，在全国各地皆有栽培，适应性广且树势强，丰产早熟[1]。玉露香是以品质良好、香味口感上佳的新疆梨‘库尔勒香梨’为母本，由山西省农业科学院果树研究所育成。‘库尔勒香梨’原产新疆，在山西、河南、河北、山东等地亦表现优异，给果农带来可观收益[2]。但是，在江苏、浙江等南方地区引种栽培发现，‘库尔勒香梨’及其杂交后代‘玉露香’等结实率低，主要是早期花芽分化发育不佳。

植物对环境非常敏感，植物的分布和物候随着气候变化而发生变化。这种生长和发育变化需要将多种环境信号(如光和温度)整合到内源性基因表达程序中，生物钟系统在这一过程中发挥着关键作用[3]。在多种植物中研究表明，植物的生物钟系统参与成花过程调控[4]。已报道elf3突变体表现出提前开花且光周期不敏感，elf3基因作为重要的生物钟基因主要在晚间表达[5]。在拟南芥中已报道，elf3可与lux、elf4、gi、cop1、phyb、pif4、svp和toc1等蛋白结合，整合生物钟、光周期、光质和温度等外界信号，调控成花过程[6]。elf3蛋白在梨、苹果、番茄、大豆、拟南芥、水稻和玉米等物种中都比较保守，但尚未有明确的功能结构域。通过经典遗传学手段，已定位到与大豆开花期相关的j基因，即大豆中的elf3基因[7]。选择不同纬度种植的大豆资源分析j基因发现存在序列多态性，通过多种实验证明由于elf3基因的多态性使大豆可以分布在更广泛的纬度范围。同样，光周期作为纬度相关的环境因素对梨树乃至蔷薇科果树的成花过程也有重要影响。本专利基于砂梨和新疆梨代表性品种的elf3同源基因进行序列分析及功能验证，找到了一个多态性位点，大小为58bp。该位点缺失时，可以使梨pbelf3b基因在植物中具有更强的延迟开花活性。

[1]张树军,刘晓东,石德喜,吕志华,“翠玉”“翠冠”梨在济宁地区的引种表现及效益分析,林业科技通讯,(2019)105-106.

[2]王苏珂,李秀根,郭献平,郑洁,王龙,薛华柏,苏艳丽,杨健,优异地方品种‘库尔勒香梨’在育种上的应用,果树学报,35(2018)26-30.

[3]d.ezer,j.h.jung,h.lan,s.biswas,l.gregoire,m.s.box,v.charoensawan,s.cortijo,x.lai,d.stockle,c.zubieta,k.e.jaeger,p.a.wigge,theeveningcomplexcoordinatesenvironmentalandendogenoussignalsinarabidopsis,natplants,3(2017)17087.

[4]c.bendix,c.m.marshall,f.g.harmon,circadianclockgenesuniversallycontrolkeyagriculturaltraits,molplant,8(2015)1135-1152.

[5]m.t.zagotta,k.a.hicks,c.i.jacobs,j.c.young,r.p.hangarter,d.r.meeks-wagner,thearabidopsiself3generegulatesvegetativephotomorphogenesisandthephotoperiodicinductionofflowering,plantjournal,10(1996)691-702.

[6]h.huang,d.a.nusinow,intotheevening:complexinteractionsinthearabidopsiscircadianclock,trendsgenet,32(2016)674-686.

[7]s.lu,x.zhao,y.hu,s.liu,h.nan,x.li,c.fang,d.cao,x.shi,l.kong,t.su,f.zhang,s.li,z.wang,x.yuan,e.r.cober,j.l.weller,b.liu,x.hou,z.tian,f.kong,naturalvariationatthesoybeanjlocusimprovesadaptationtothetropicsandenhancesyield,natgenet,49(2017)773-779.

技术实现要素：

本发明的目的在于鉴定不同品种新疆梨和砂梨在pbelf3b基因序列上存在的差异，并明确其在调节植物开花过程中的功能，开发梨花芽分化发育的基因特异性分子标记及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种分离克隆自砂梨具有延迟植物开花性状的功能基因pbelf3b(n型)，其基因组dna序列如序列表seqidno.1所示。

一种分离克隆自新疆梨具有延迟植物开花性状的功能基因pbelf3b(d型)，其基因组dna序列如序列表seqidno.2所示。

用于扩增上述的梨pbelf3b等位基因n型和d型全长序列的引物对也属于本发明专利的保护范围，该引物对的dna序列如seqidno.6和seqidno.7所示。

一种与梨花芽分化发育相关的indel分子标记，该indel分子标记序列如seqidno.3所示，梨pbelf3b基因组内含子上该indel分子标记序列的存在或缺失会影响植物开花性状。该indel分子标记序列的缺失会导致pbelf3b基因具有更强的延迟开花活性。

上述的与梨花芽分化发育相关的indel分子标记的引物，该引物的正向引物pbelf3b-indel-f的序列为tcgttgtgttaactgttttctg，反向引物pbelf3b-indel-r的序列为ccaaacaaatccccactatg。

上述的分子标记或上述的分子标记的引物在检测梨花芽分化发育情况或梨新品种辅助选育中的应用。

一种利用砂梨pbelf3b(n型)功能基因改造的pbelf3b(n-d型)基因，其核苷酸序列如序列表seqidno.13所示。

一种利用新疆梨pbelf3b(d型)功能基因改造的pbelf3b(d+d型)基因，其核苷酸序列如序列表seqidno.14所示。

用于扩增上述改造的pbelf3b基因全长序列的引物对也属于本发明专利的保护范围，其中，用于扩增改造的砂梨中n-d型pbelf3b基因的引物对如seqidno:9和seqidno:10所示；用于扩增改造的新疆梨中d+d型pbelf3b基因的引物对如seqidno:11和seqidno:12所示。

含有上述基因的重组载体及载体的工程菌也属于本发明专利的保护范围。

上述基因在延迟植物开花方面的应用也属于本发明专利的保护范围。上述的应用的具体过程为将所述的工程菌侵染植株，获得开花延迟的转基因植株。

根据已获得的砂梨和新疆梨重测序结果，挖掘分别对应的pbelf3b基因dna全长信息(序列见seqidno:1和seqidno:2)，发现在外显子上有3个同义突变，在内含子上有2个碱基突变和一个58bp的indel变异(序列见seqidno:3)。砂梨中获得的pbelf3b等位基因命名为n型，而新疆梨中获得的pbelf3b等位基因命名为d型。申请人根据pbelf3b基因内含子第2670-2728位的indel序列差异设计一对基于pcr的indel特异性标记，该标记由两条引物序列组成，具体dna序列如下所示：正向引物pbelf3b-indel-f：5’-tcgttgtgttaactgttttctg-3’，反向引物pbelf3b-indel-r：5’-ccaaacaaatccccactatg-3’(如seqidno:4和seqidno:5所示)。在4份砂梨叶片、4份砂梨花芽、4份新疆梨叶片和4份新疆梨花芽dna样品中进行pcr扩增，同样引物扩增获得的片段大小不一致，发现这种indel差异是真实存在的。

将砂梨和新疆梨分别对应的pbelf3b基因全长dna序列克隆并构建于拟南芥过表达载体。将构建好的表达载体利用农杆菌浸花法转化拟南芥col-0，获得转基因t1和t2代阳性苗。结果表明在长日照条件下，过表达新疆梨pbelf3b的d型基因序列的拟南芥植株开花晚于过表达砂梨pbelf3b的n型的拟南芥植株，而且两种转基因植株的开花时间都要晚于对照组拟南芥。无论开花时间或是莲座叶数都得到一致的结果。在两类转基因阳性苗中利用indel特异性标记引物检测对应叶片dna样品，发现两类转基因阳性苗中同样存在indel差异。由此认为砂梨和新疆梨pbelf3b等位基因都具有延迟植物开花作用，但是新疆梨pbelf3b的d型等位基因的延迟作用强于砂梨的n型等位基因。

为排除外显子上的3个同义突变和内含子上的2个碱基突变影响，明确indel变异的功能，设计特异性基因改造引物分别对砂梨和新疆梨模板进行重新扩增，获得对应片段并使用多片段同源重组方式构建新的pbelf3b等位基因型，分别是n-d(即砂梨型pbelf3b基因删除indel序列)和d+d(即新疆梨型pbelf3b基因补充indel序列)(如seqidno:13和seqidno:14所示)。

将改造后n-d型和d+d型分别对应的pbelf3b全长dna序列同样构建于拟南芥过表达载体并且获得以col-0为背景的转基因t1和t2代阳性苗。结果表明在长日照条件下，过表达d+d型基因序列的拟南芥植株开花时间与对照组无显著差异，莲座叶数略大于对照组，而过表达n-d型基因序列的拟南芥植株显著晚于对照组拟南芥开花，且莲座叶数显著增加。同时在两类转基因阳性苗中利用indel特异性标记引物检测对应叶片dna样品，发现两类转基因阳性苗中存在indel差异。由此说明新疆梨pbelf3b等位基因内含子上缺失的indel序列具有延迟植物开花作用。

本发明分子标记和筛选方法可用于常规梨品种或杂交梨后代的辅助选育新品种中。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。

序列表seqidno:1是本发明克隆的砂梨中pbelf3b基因n型的全长dna序列，其片段长度为4163bp。

序列表seqidno:2是本发明克隆的新疆梨中pbelf3b基因d型的全长dna序列，其片段长度为4105bp。

序列表seqidno:3是本发明克隆的新疆梨中pbelf3b基因d型与克隆的砂梨中pbelf3b基因n型序列相比缺失的58bp序列。

序列表seqidno:4和seqidno:5是本发明筛选的indel序列特异性分子标记引物的核苷酸序列。

序列表seqidno:6和seqidno:7是本发明克隆梨pbelf3b基因全长序列的引物的核苷酸序列。

序列表seqidno:8是基因构建于过表达载体的测序引物的核苷酸序列。

序列表seqidno:9和seqidno:10是本发明克隆改造的砂梨中pbelf3b基因n-d型的引物的核苷酸序列。

序列表seqidno:11和seqidno:12是本发明克隆改造的新疆梨中pbelf3b基因d+d型的引物的核苷酸序列。

序列表seqidno:13是本发明克隆改造的砂梨中pbelf3b基因n-d型的全长dna序列，其片段长度为4105bp。

序列表seqidno:14是本发明克隆改造的新疆梨中pbelf3b基因d+d型的全长dna序列，其片段长度为4163bp。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

克隆和分离了砂梨和新疆梨中pbelf3b基因，并鉴定了pbelf3b基因两种对应基因型n型和d型基因在延迟开花中分别发挥的作用。

通过序列差异比对，设计针对pbelf3b基因内含子中indel序列的特异性分子标记引物，并通过基因改造构建n-d型和d+d型pbelf3b基因的等位基因，证实58bp的d片段缺失可以导致pbelf3b基因具有更强的延迟开花的作用。

pbelf3b基因indel序列的发现及其特异性分子标记引物的设计可以作为鉴别梨花芽分化发育状况的分子标记，从而提高育种效率。

附图说明

图1、梨pbelf3b基因结构和58bp缺失片段的位置。

图2、不同砂梨和新疆梨叶片和花芽中pbelf3b基因indel序列扩增的pcr检测。附图标记说明，泳道1-4是砂梨叶片样品，泳道5-8是砂梨花芽样品，泳道9-12是新疆梨叶片样品，泳道13-16是新疆梨花芽样品；泳道m表示10kbmarker，条带大小从上往下依次是10000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中最亮条带为1000bp。

图3、砂梨和新疆梨pbelf3b基因n型和d型的dna全长扩增的pcr产物检测。附图标记说明：泳道m表示10kbmarker。

图4、过表达砂梨pbelf3b等位基因n型的拟南芥表型。附图标记说明：图4中a图n-oe7、n-oe13、n-oe27为过表达砂梨pbelf3b等位基因n型的拟南芥株系，vectorcontrol是过表达空载的拟南芥对照组；图4中b图是长日照条件拟南芥过表达阳性株系与对照组的开花时间和莲座叶数目的统计比较。

图5、过表达新疆梨pbelf3b等位基因d型的拟南芥表型。附图标记说明：图5中a图d-oe6、d-oe10、d-oe23为过表达新疆梨pbelf3b等位基因d型的拟南芥株系，vectorcontrol是过表达空载的拟南芥对照组；图5中b图是长日照条拟南芥过表达阳性株系与对照组的开花时间和莲座叶数目的统计比较。

图6、pbelf3b等位基因特异性标记indel序列在转基因拟南芥中检测。附图标记说明：泳道1-8是pbelf3b-d-oe转基因拟南芥的dna样品，9-16是pbelf3b-n-oe转基因拟南芥的dna样品。泳道m表示10kbmarker。

图7、改造砂梨和新疆梨pbelf3b基因dna分段扩增的pcr产物检测。附图标记说明：设计pbelf3b-n-d基因改造引物，利用砂梨的dna作为模板，分段克隆pbelf3b基因的dna序列，pbelf3b-n-d-1和pbelf3b-n-d-2片段大小分别是2670bp和1442bp；设计pbelf3b-d+d基因改造引物，利用新疆梨的dna作为模板，分段克隆pbelf3b基因的dna序列，pbelf3b-d+d-1和pbelf3b-d+d-2片段大小分别是2707bp和1475bp。泳道m表示10kbmarker。

图8、过表达改造后pbelf3b等位基因d+d型的拟南芥表型。附图标记说明：图8中a图d+d-oe1、d+d-oe11、d+d-oe18为过表达改造后pbelf3b等位基因d+d型的拟南芥株系，vectorcontrol是过表达空载的拟南芥对照组；图8中b图是长日照条件拟南芥过表达阳性株系与对照组的开花时间和莲座叶数目的统计比较。

图9、过表达改造后pbelf3b等位基因n-d型的拟南芥表型。附图标记说明：图9中a图n-d-oe2、n-d-oe4、n-d-oe24为过表达改造后pbelf3b等位基因n-d型的拟南芥株系，vectorcontrol是过表达空载的拟南芥对照组；图9中b图是长日照条拟南芥过表达阳性株系与对照组的开花时间和莲座叶数目的统计比较。

图10、pbelf3b等位基因特异性标记indel序列在改造后的转基因拟南芥中检测。附图标记说明：泳道1-9是pbelf3b-d+d-oe转基因拟南芥的dna样品，10-18是pbelf3b-n-d-oe转基因拟南芥的dna样品。泳道m表示10kbmarker。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1：砂梨和新疆梨pbelf3b基因内含子区域的indel序列鉴定

根据南京农业大学梨工程技术中心的白梨基因组数据库和不同梨品种重测序数据，通过同源比对方式获得砂梨和新疆梨pbelf3b基因的全长dna序列。利用muscle(https://www.ebi.ac.uk/tools/msa/muscle/)对两个品种的序列进行比对分析，序列信息如seqidno：1和序列信息如seqidno：2所示。比对结果显示，在外显子上两者有3个同义突变，在内含子上有2个碱基突变和1个长片段的indel序列。具体表现为新疆梨相对于砂梨序列有一58bp片段缺失(图1)。因此，分别命名砂梨pbelf3b基因为n型，新疆梨pbelf3b基因为d型。

针对pbelf3b基因n型和d型之间缺失序列的差异，设计了特异性标记引物，正向引物pbelf3b-indel-f：tcgttgtgttaactgttttctg(seqidno：4)，反向引物pbelf3b-indel-r:ccaaacaaatccccactatg(seqidno：5)。利用indel特异性标记引物pcr扩增鉴定了4份砂梨叶片、4份砂梨花芽、4份新疆梨叶片和4份新疆梨花芽。pcr反应体系(20μl)：10μl2×taqmix(包含taq酶、缓冲液和dntp等)，10μm的正向和反向引物各1μl，1μldna模板，ddh2o补齐至20μl。反应程序为：95℃预变性5min；35个扩增循环，包括95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s；循环完成后72℃延伸10min，20℃保温5min。取pcr扩增产物9μl，加入1μl10×上样缓冲液，经过1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶成像仪观察获得如图2所示的条带。其中所有砂梨样品显示一致的片段长度，即pbelf3b基因n型indel特异性标记扩增产物长度292bp；而所有新疆梨样品显示一致的片段长度，即pbelf3b基因d型indel特异性标记扩增产物长度234bp。

实施例2：砂梨和新疆梨pbelf3b基因的克隆及载体构建

根据重组酶构建载体需求选择载体和pbelf3b基因的序列，用primerpremier5.0设计引物，分别以两种代表梨品种对应的dna为模板进行pcr扩增全长。详细步骤如下：

研究材料砂梨的代表品种‘翠冠’和新疆梨的代表品种‘库尔勒香梨’种植于南京农业大学园艺学院江浦梨种质资源中心，树龄为10年左右。均挑选生长健康的梨叶片，随机称取500mg样品，立即用液氮速冻，采用植物基因组dna提取试剂盒(购自成都福际生物，中国)提取dna样品，完全按照说明书步骤操作。提取完成后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dna的质量，并用分光光度计检测dna的浓度和质量。

利用设计的特异性引物对砂梨n型和新疆梨d型的pbelf3b基因的dna全长序列分别进行扩增。扩增引物如下：pbelf3b-gfp-f：gagaacacgggggactctagaatgaggagggggaacgag(seqidno：6),pbelf3b-gfp-r：gcccttgctcaccatggatccggttgaatcctgctgttttctc(seqidno：7)，其中下划线标注的为载体多克隆位点上下游同源序列。扩增体系优选为50μl体系，所述扩增体系包括100ng模板dna，10μl5×phusiongcbuffer，1μldntps(10mm)、1μlphusionhigh-fidelitydnapolymerase，10.0μm正向引物和10.0μm的反向引物2.5μl，补充ddh2o至50μl。本发明中所述的phusionhigh-fidelitydnapolymerase购自thermoscientific。本发明中所述扩增反应的程序优选为：98℃预变性2min；30个扩增循环，包括98℃变性10s、60℃退火30s、72℃延伸4min；循环完成后72℃延伸10min，20℃保温5min。取pcr扩增产物50μl，加入5μl上样缓冲液10×loadingbuffer，经过1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶成像仪观察获得pbelf3b基因n型和d型分别对应的4163bp和4105bp的产物(如图3所示)，按照凝胶试剂盒(购自康为世纪，中国)的使用说明提取步骤回收目的条带。

载体pcambia1300-35s:cds-gfp(fangandspector,2010)质粒使用xbai和bamhi限制性内切酶进行双酶切反应，50μl酶切反应体系包括：1μg载体质粒dna、6μl缓冲液、2μlxbai和2μlbamhi，补充ddh2o至50μl。双酶切3小时后回收酶切后的线性化载体片段。利用分光光度计检测基因扩增片段和酶切载体片段的浓度和质量并记录。使用重组酶系统连接基因片段和载体片段。首先，按照说明书中公式和片段长度及载体长度计算对应浓度，结合分光光度计测定浓度获得所需pcr扩增基因片段和酶切载体回收产物的体积。反应体系20μl如下：计算后的基因片段体积，线性化载体体积，4μl5×ceiibuffer，2μlexnaseii，补充ddh2o至20μl。37℃反应30min，立即置于冰上冷却。取10μl重组产物，采用热击法转化大肠杆菌dh5α，在含有100mg/l卡纳霉素的lb固体平板中筛选阳性克隆，挑取3个阳性克隆测序确认。利用载体上一段序列作为测序引物gfp-r:cgtcgtccttgaagaagatg(seqidno：8)对挑选的阳性单克隆测序，测序结果表明基因片段已构建于载体，而且基因序列与数据库预测结果完全一致，砂梨n型和新疆梨d型pbelf3b基因的dna全长序列存在上述提到的碱基突变及indel序列。

实施例3：砂梨和新疆梨pbelf3b基因功能鉴定

测序正确的重组质粒分别命名为pcambia1300-35s:pbelf3b-n-gfp和pcambia1300-35s:pbelf3b-d-gfp，简称为pbelf3b-n和pbelf3b-d。提取对应重组质粒。应用冻融法将重组质粒pbelf3b-n和pbelf3b-d导入到农杆菌gv3101中，获得阳性农杆菌菌株。

农杆菌侵染拟南芥采用经典浸花法，具体步骤如下：

首先，将保存于超低温冰箱(-80℃)中的阳性农杆菌菌株在添加了卡那霉素100mg/l和利福平50mg/l的lb的平板培养基上划线进行活化，28℃培养箱倒置培养1-2天，挑取生长状态良好的单克隆于添加了卡那霉素100mg/l和利福平50mg/l的100mllb液体培养基中振荡培养，28℃220rpm/min振荡培养至od600至0.6-0.8时收集菌体，室温5000rpm/min离心10min，多次重复至收集全部菌体。其次，配制诱导侵染液，1/2ms、5％蔗糖、10μg/l6-ba，koh调ph至5.70，0.025％sillwet-77，菌体重悬于等体积侵染液中。选择抽薹后待开花的野生型拟南芥col-0倒扣于装有重悬液的100ml烧杯中，使整个花序浸泡在菌液中，抽真空至380mmhg，侵染时间7min。侵染后的拟南芥植株于22℃环境中黑暗培养过夜，随后取出植株正常培养，待收获种子。

转基因拟南芥阳性幼苗使用潮霉素筛选，再利用pcr技术鉴定，具体步骤如下：

从分别侵染了pbelf3b-n和pbelf3b-d农杆菌菌液的拟南芥上收获成熟的t1代种子，加入硅胶干燥7天后进行筛选。在超净工作台中准备灭菌的蓝枪头和ddh2o，70％乙醇消毒1min，无菌ddh2o清洗3遍，10％次氯酸钠溶液消毒5min，无菌ddh2o清洗5遍。对t1代种子表面消毒清洗后播种于含20mg/l潮霉素、100mg/l特美汀、100mg/l羧苄青霉素钠的ms培养基上，先置于4℃黑暗条件培养3天再正常培养于长日照条件下(16h光照/8h黑暗)。阳性幼苗在长日照下生长至10-12天，移栽至营养土：蛭石＝1:1.5的营养钵中，正常生长至成熟，按单株收获t2代种子。在生长过程中分别统计pbelf3b-n和pbelf3b-d转基因幼苗的开花时间和开第一朵花时的莲座叶数。

在转基因苗生长至开花时，分别剪取每株2片莲座叶为材料，采用ctab法提取拟南芥dna。ctab法提取拟南芥dna的具体步骤如下：首先，取拟南芥叶片于1.5ml离心管中，加入400μlctab缓冲溶液(2％ctab，100mmol/ltris-hclph8.0，20mmol/ledta,1.4mol4/lnacl)，充分研磨；研磨后样品65℃孵育1h，室温冷却后加入500μl氯仿，剧烈振荡3min，室温10000g离心10min；将上清液转移至新的1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，轻柔颠倒混匀，室温10000g离心10min；小心去除上清液，用70％乙醇洗涤沉淀，彻底去除乙醇后静置干燥；加入40μl灭菌ddh2o溶解，待做pcr扩增模板。

使用针对pbelf3b基因n型和d型之间缺失序列差异设计的特异性标记引物seqidno：4和seqidno：5完成pcr反应鉴定阳性苗。pcr反应体系(20μl)和反应程序与实施例1中pcr相同，分别使用不同的模板检测。

根据pcr鉴定结果和表型统计结果，pbelf3b-n和pbelf3b-d转基因苗分别选择3株作为代表，将收获的t2代种子同样经过消毒清洗和筛选后移栽至营养钵中，在相同的长日照培养环境下生长，统计开第一朵花时间和莲座叶数。pbelf3b-n和pbelf3b-d转基因苗表型结果分别如图4和图5所示。对照组拟南芥平均开花时间为照光后24.7天，而pbelf3b-n转基因苗平均开花时间是25.9天，pbelf3b-d转基因苗则平均需要28.1天。开第一朵花时对照组拟南芥平均莲座叶数为8.4片，而pbelf3b-n转基因苗平均是9.5片，pbelf3b-d转基因苗平均莲座叶数是11.5片。与对照植株相比两类转基因苗均延迟开花时间并增加了莲座叶数，但pbelf3b-d转基因苗延迟开花效果更显著，说明pbelf3b等位基因都具有延迟拟南芥开花的作用，但是新疆梨中d型pbelf3b等位基因的延迟作用强于砂梨中n型等位基因。使用针对pbelf3b基因n型和d型之间缺失序列差异设计的特异性标记引物seqidno：5和seqidno：6鉴定两类转基因阳性苗dna(图6)，明确t2代幼苗中确实存在pbelf3b等位基因indel序列的情况。pbelf3b基因n型扩增产物长度292bp，而pbelf3b基因d型扩增产物长度234bp。

实施例4：砂梨和新疆梨pbelf3b基因改造

在明确砂梨和新疆梨中分别存在的两类pbelf3b等位基因在延迟植物开花方面具有一定功能且新疆梨d型转基因阳性苗表型更明显情况下，仍需进一步实验证明是否由于indel序列差异导致的砂梨和新疆梨pbelf3b基因的功能差异。改造砂梨和新疆梨pbelf3b基因，目标获得没有外显子和内含子碱基突变只有indel区域序列缺失的pbelf3b基因n-d型和只有外显子和内含子碱基突变没有indel区域序列缺失的pbelf3b基因d+d型。

设计引物如下：

pbelf3b-gfp-f:gagaacacgggggactctagaatgaggagggggaacgag

pbelf3b-n-d-r1:agtatctgcttaggcgtgatattgatcagga

pbelf3b-n-d-f2:cgcctaagcagatactttgtgactaaagcacttag

pbelf3b-gfp-r:gcccttgctcaccatggatccggttgaatcctgctgttttctc

pbelf3b-d+d-r1:agcccattaactccacctgaccaaccccaaggtaatccttaggcgtgatattgatcaggat

pbelf3b-d+d-f2:gtggagttaatgggctatggtgtttttcacgggtaagcagatactttgtgactaaagcacttagtc

具体基因改造及载体构建过程如下：

使用实施例2中已提及的砂梨和新疆梨dna样品为模板，分段克隆所需的改造基因片段。pbelf3b基因n-d型构建过程是以砂梨dna为模板，pbelf3b-gfp-f/pbelf3b-n-d-r1、pbelf3b-n-d-f2/pbelf3b-gfp-r两组引物，使用高保真dna聚合酶进行pcr反应。pcr反应体系(50μl)：100ng模板dna，10μl5×pcr缓冲液，1μldntps(10mm)、1μl高保真dna聚合酶(2u)，10.0μm正向引物和10.0μm的反向引物2.5μl，补充ddh2o至50μl。反应程序为：98℃预变性2min；30个扩增循环，包括98℃变性10s、60℃退火30s、72℃延伸2.5min；循环完成后72℃延伸10min，20℃保温5min。取pcr扩增产物50μl，加入5μl上样缓冲液10×loadingbuffer，经过1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶成像仪观察获得pbelf3b基因n-d型分段对应的产物pbelf3b-n-d-1是2670bp和pbelf3b-n-d-2是1442bp的产物(图7)。同时扩增pbelf3b基因d+d型，以新疆梨dna为模板，pbelf3b-gfp-f/pbelf3b-d+d-r1、pbelf3b-d+d-f2/pbelf3b-gfp-r两组引物，同样的pcr体系和程序，获得pbelf3b基因d+d型分段对应的产物pbelf3b-d+d-1是2707bp和pbelf3b-d+d-2是1475bp的产物(图7)。回收对应长度的特异性片段，并使用分光光度计检测pcr产物回收的浓度和质量。

使用多片段重组酶分别将pbelf3b基因n-d型和d+d型的两个pcr扩增片段构建于pcambia1300-35s:cds-gfp质粒。基本步骤与上述已提及内容相似，首先需要根据不同基因片段和载体片段的长度和浓度计算使用的体积，反应体系改为需要连接的基因片段1、基因片段2和线性化载体片段体积，4μl5×ceiibuffer，2μlexnaseii，补充ddh2o至20μl。重组质粒转入dh5α大肠杆菌感受态，并用pbelf3b-gfp-f和pbelf3b-gfp-r引物鉴定阳性克隆，每个基因型挑选3个阳性克隆使用gfp-r引物进行测序验证。获得目标序列，并且正确构建于载体上，pbelf3b基因n-d型和d+d型改造后序列分别如seqidno：13和seqidno：14所示。其中pbelf3b基因n-d型序列中仅存在indel序列58bp缺失，而pbelf3b基因d+d型序列中存在内含子上的2个碱基突变和第四个外显子上的3个同义突变。

实施例5：砂梨和新疆梨pbelf3b基因indel序列功能鉴定

测序正确的重组质粒分别命名为pcambia1300-35s:pbelf3b-n-d-gfp和pcambia1300-35s:pbelf3b-d+d-gfp，简称为pbelf3b-n-d和pbelf3b-d+d。将测序正确的重组质粒分别转入农杆菌gv3101中，并使用实施例3中所提及的侵染拟南芥的方法侵染野生型拟南芥col-0，筛选鉴定t1代和t2代转基因过表达阳性苗，并统计开花时间和开第一朵花时的莲座叶数。根据鉴定和观察的t1代阳性苗结果，分别选择3个过表达株系筛选和种植t2代阳性苗统计分析表型。第一朵花开花时间统计结果为对照组拟南芥照光后需要25.2天，pbelf3b-d+d的3个转基因株系平均时间是25.1天，而pbelf3b-n-d的3个转基因株系平均时间是29.3天。同时，开第一朵花时植株的莲座叶数统计结果是对照组拟南芥是9.6片叶，而pbelf3b-d+d和pbelf3b-n-d转基因株系平均莲座叶数分别是10.4和11.9片叶。所以相对于对照组拟南芥表型结果是，pbelf3b-n-d的3个转基因株系均表现出显著的延迟开花时间和增加莲座叶数(图9)，即明显的抑制了拟南芥植株开花性状，而pbelf3b-d+d的3个转基因株系在莲座叶数方面表现出增加，但增加数目不显著，且对开花时间没有统计学意义上的延迟(图8)。同样使用为indel序列差异设计的特异性标记引物seqidno：4和seqidno：5鉴定两类转基因阳性苗dna(图10)，在pbelf3b-d+d的转基因株系阳性苗中扩增产物片段长为292bp，而在pbelf3b-n-d的转基因株系阳性苗中扩增产物片段长为234bp，即两个pbelf3b基因型的对应转基因株系中确实存在内含子上特定区域的缺失差异。结合表型结果和pcr鉴定结果说明，存在的内含子58bp序列缺失影响了pbelf3b基因，并且导致了拟南芥开花显著延迟。

结合四组pbelf3b基因型序列及转基因阳性苗的开花表型，认为新疆梨pbelf3b基因内含子上存在的58bp长片段缺失会影响植物开花性状。因此根据内含子缺失片段设计的indel序列特异性标记引物seqidno：4和seqidno：5，可以作为鉴别梨花芽分化发育状况的分子标记，从而提高育种效率，也可使用基因工程方法将pbelf3b的不同类型用于其他植物物种开花时间调控。

seqidno：1pbelf3b-n

atgaggagggggaacgaggagaaggttatgggacctatgttcccaaggctccatgtgaatgatgcagataaaggagggccgagagctcctccaagaaacaagatggccctctatgagcagctgagcatcccatctcagaggttcaatcctggggtgctgcctttgaattcaaataaccaggtaatttaatcataatttgtgcttactcttttcttaattatttgtttggattattttgaaatgttattgctttaaacttgtagttaggtaatggattttctcaggctttttggttttttgtttttgtagtagttaactgtaagtgttgttttatgctatattgagtaatgttgcatatgactatgtctatatgtcgtgttttaatggctattaattgtaaaaaaagaagttaaaatatgccaagatagctactatttgcagcatgctgcaattaagagggaaaaaacaacggtgtgttgataaatagtgttgcaagcttgtttagtatggacggaaaatgattatcgcgtatctgaattttgggagcaatttatgttttcaggggagtcgttcagatggaaatttggcttttccacttcgtggtcgtacatctacacctactcatcaggctgtgatgtttcatggtcgccagtctgacagagcaaatgtaaacgtgccatttgaacacaccgacctaagaaggaagatcggagatgaagatgattttagtgttcctgtatttgttcaatcaaggatgggtcttggtcacagtaaaactccaattggtagtgaggaaaaacttacttccatcagctcgcctcattctgaccatttagtaaaagtaagaaacgtggggaagaaggatccaaaacaaataagctccccaactctgaatttaacacgagaattgagaagtgaaagagaagaggacctaatagaagtaagcggttcgagtaagggccattcaggaaaatttgccgcaaaaatatcaaccatacaaaagattgatgggcccgtagaagcgaatgcatcaccaaatcaagaggatgcagaatgttctgttccgagattcaacaggttagctgagagtgatgcttgcttacaacaagagtctagatctgggtcacagccaaacgttactggacaaggtgatggtcttgttgagtcttcaagggatgtagagaagggaactctttcccaggaaaaaagtgtttcttgttctggggcggatcctaccagtcccaatgaccctgataatgacagcgaataccgtggagacagaaagtgtatttcacttcaaatgggacatgtagacaaaagtgatgatgtctcagagacctccatggtggattctatatccggcatggacatctctcctgatgatgttgtaggaataataggccagaaacatttctggaaggcaagaaaagcaattgtcaagtaagtctctattttctccagtagttcatttcagttgttactttgcgctttagaattttgaagttcacttttttcccagtatgcagtatatgaagcatttggtctcataatatcttcgtgttgttgagtatttcttcacttatgttttgtgattattttttttctgtttcttttttaattcttccgtatggctgtcttagactgttatttatataacaattaggaatatagatataatttgaagggaggtgagatttcatagtacagagtcccgggattccttctaaagtggaattattttgtgttataaggccctcgataacattttaacagtggatatggatcgtcttacagcagggataaatacatcttaatagagttaccttgtgcaacgtgacctccgagacggcatatcatctcgttattcattgcctttttgtatctgcctgttgggtttattcctgtctcggtttggtaatgcttgggggtttccctgttcactatcaaaagatttcccttcatggcacttgagggctgggagcaagaaggggaacaagtaatgaaggattatccttgggactacattgtgtggatcttggactatatttgagaatatagttgacatggtggtgaggaggattacatctcttatgtagtattttgatgtggtgtattggaagttggaagattttattaggtcggggtttgtgttgtctttcttatacgctttatagaatatgagagtatcccctatatatgggttcttctaatcattacaccttttttatttttcattatgaaatgtgaatcatttacatgtgaatcagaaagctttagtttgtacatttcttttatgattttaattgaatattacaaattttaagctgtttttgtgttaaagaaaggagatttgcagacatctaaatgatttatgtcgcagatatttgccatgtttcagaatctgttgtagcatttagctttcgtttttattgctctgaagatttatgtcgcagatatttgctatgttttggatctgttgtagcatttagctatcgttttatagttttgaagtggtttttgtatccattattaattttattgctctgaattacctcgttgtgttaactgttttctgatgagcaatttgctgcatccatccttaagctgtttccttcccatgtttggtaaatgtcatatttgtctacaatcctgatcaatatcacgcctaaggattaccttggggttggtcaggtggagttaatgggctatggtgtttttcacgggtaagcagatactttgtgactaaagcacttagtcatttttctgttatctcttaaataacatgagtttctattttctgttccgatgcatgtaatccaataatccatagtggggatttgtttggtacaaatgattgtcaactgcccaatttttcatttttttgtccagtttattgttttgttttctcgtattggttttgtttttgtgatttaccaagcttcatatggtttggtgtgtattgtgcaactatgtttttgacatgactccttgtactttctacagtcagcaaagattgtttgcggttcaagtatttgagttgcatagactcattaaggtaagactaaatggatggattgtgtttgatttctttttgttgagaatgtacacacacgcgcgcatatcagttgacttagattggaaaaattagctgaataaaattcttttttgaacaggtccaacgactgattgctggatctccacatcttttgcttgaagatactgcttttctgggcacatctactttaaggggatccccggcaacaaaactctcatcagagtatgttgtaaagccactactacatgttgtaaagcgcaaacacgaacctgagaagccaaacaacaaaatggaatgttctgcggaaaatgcagtagggaaaagccagtccttggtgtttccatatttaggaaatccacagccaactcctatggcttctgataaagccagtccttggtgtttccatcagtctcctggacatcaattgttaattccagtaatgtcgccttctgaaggacttgtgtacaagccgtataatggaccaggatttatgggagggccagtttgtggaggatgtggaccctacggctcaactccgatgatgggcaactttgttaagccatcttacggggttccatctcatcatcttcaaggaatgggggttcttcctgtccctccatcactcaatggtcatacttactttcctccatatggcatgtccgttatgaatcctgccatgccgagctcagcagttgaacaaatgcattggtttgctggacccgtttcccatggtcacaccgatcagtcatcgggagggggtgcaaactccaatttgcagcaccaaagctcatgcaacatgccccagaaaaatgtcaccattcctaacgccaaaaggcttcagccatctaatgacagtgggttacaaggaagtacagcaaataatacaggcgacagagccccaatgaggacggatcaaaatcctgaaggaagcgatgcgctccaacttttccccatggctccagtgattccagacggagttccccaatctcacgacataggccagccaatgcgagctataaaagttgtgcctcacaatccaagaactgcaactgcgtcggctgctcgaattttccagtccatacaagcagagagaaaacagcaggattcaacctag

seqidno：2pbelf3b-d

atgaggagggggaacgaggagaaggttatgggacctatgttcccaaggctccatgtgaatgatgcagataaaggagggccgagagctcctccaagaaacaagatggccctctatgagcagctgagcatcccatctcagaggttcaatcctggggtgctgcctttgaattcaaataaccaggtaatttaatcataatttgtgcttactcttttcttaattatttgtttggattattttgaaatgttattgctttaaacttgtagttaggtaatggattttctcaggctttttggttttttgtttttgtagtagttaactgtaagtgttgttttatgctatattgagtaatgttgcatatgactatgtctatatgtcgtgttttaatggctattaattgtaaaaaaagaagttaaaatatgccaagatagctactatttgcagcatgctgcaattaagagggaaaaaacaacggtgtgttgataaatagtgttgcaagcttgtttagtatggacggaaaatgattatcgcatatctgaattttgggagcaatttatgttttcaggggagtcgttcagatggaaatttggcttttccacttcgtggtcgtacatctacacctactcatcaggctgtgatgtttcatggtcgccagtctgacagagcaaatgtaaacgtgccatttgaacacaccgacctaagaaggaagatcggagatgaagatgattttagtgttcctgtatttgttcaatcaaggatgggtcttggtcacagtaaaactccaattggtagtgaggaaaaacttacttccatcagctcgcctcattctgaccatttagtaaaagtaagaaacgtggggaagaaggatccaaaacaaataagctccccaactctgaatttaacacgagaattgagaagtgaaagagaagaggacctaatagaagtaagcggttcgagtaagggccattcaggaaaatttgccgcaaaaatatcaaccatacaaaagattgatgggcccgtagaagcgaatgcatcaccaaatcaagaggatgcagaatgttctgttccgagattcaacaggttagctgagagtgatgcttgcttacaacaagagtctagatctgggtcacagccaaacgttactggacaaggtgatggtcttgttgagtcttcaagggatgtagagaagggaactctttcccaggaaaaaagtgtttcttgttctggggcggatcctaccagtcccaatgaccctgataatgacagcgaataccgtggagacagaaagtgtatttcacttcaaatgggacatgtagacaaaagtgatgatgtctcagagacctccatggtggattctatatccggcatggacatctctcctgatgatgttgtaggaataataggccagaaacatttctggaaggcaagaaaagcaattgtcaagtaagtctctattttctccagtagttcatttcagttgttactttgcgctttagaattttgaagttcacttttttcccagtatgcagtatatgaagcatttggtctcataatatcttcgtgttgttgagtatttcttcacttatgttttgtgattattttttttctgtttcttttttaattcttccgtatggctgtcttagactgttatttatataacaattaggaatatagatataatttgaagggaggtgagatttcatagtacagagtcccgggattccttctaaagtggaattattttgtgttataaggccctcgataacattttaacagtggatatggatcgtcttacagcagggataaatacatcttaatagagttaccttgtgcaacgtgacctccgagacggcatatcatctcgttattcattgcctttttgtatctgcctgttgggtttattcctgtctcggtttggtaatgcttgggggtttccctgttcactatcaaaagatttcccttcatggcacttgagggctgggagcaagaaggggaacaagtaatgaaggattatccttgggactacattgtgtggatcttggactatatttgagaatatagttgacatggtggtgaggaggattacatctcttatgtagtattttgatgtggtgtattggaagttggaagattttattaggtcggggtttgtgttgtctttcttatacgctttatagaatatgagagtatcccctatatatgggttcttctaatcattacaccttttttatttttcattatgaaatgtgaatcatttacatgtgaatcagaaagctttagtttgtacatttcttttatgattttaattgaatattacaaattttaagctgtttttgtgttaaagaaaggagatttgcagacatctaaatgatttatgtcgcagatatttgccatgtttcagaatctgttgtagcatttagctttcgtttttattgctctgaagatttatgtcgcagatatttgctatgttttggatctgttgtagcatttagctatcgttttatagttttgaagtggtttttgtatccattattaattttattgctctgaattacctcgttgtgttaactgttttctgatgagcaatttgctgcatccatccttaagctgtttccttcccatgtttggtaaatgtcatatttgtctacaatcctgatcaatatcacgcctaag----------------------------------------------------------cagatattttgtgactaaagcacttagtcatttttctgttatctcttaaataacatgagtttctattttctgttccgatgcatgtaatccaataatccatagtggggatttgtttggtacaaatgattgtcaactgcccaatttttcatttttttgtccagtttattgttttgttttctcgtattggttttgtttttgtgatttaccaagcttcatatggtttggtgtgtattgtgcaactatgtttttgacatgactccttgtactttctacagtcagcaaagattgtttgcggttcaagtatttgagttgcatagactcattaaggtaagactaaatggatggattgtgtttgatttctttttgttgagaatgtacacacacgcgcgcatatcagttgacttagattggaaaaattagctgaataaaattcttttttgaacaggtccaacgactgattgctggatctccacatcttttgcttgaagatactgcttttctgggcacatctactttaaggggatccccggcaacaaaactctcatcagagtatgttgtaaagccactactacatgttgtaaagcgcaaacacgaacctgagaaaccaaacaacaaaatggaatgttctgcggaaaatgcagtagggaaaagccagtccttggtgtttccatatttaggaaatccacagccaactcctatggcttctgataaagccagtccttggtgtttccatcagtctcctggacatcaattgttaattccagtaatgtcgccttctgaaggacttgtgtacaagccgtataatggaccaggatttatgggagggccagtttgtggaggatgtggaccttacggctcaactccgatgatgggcaactttgttaagccatcttacggggttccatctcatcatcttcaaggaatgggggttcttcctgtccctccatcactcaatggtcatacttactttcctccatatggcatgtctgttatgaatcctgccatgccgagctcagcagttgaacaaatgcattggtttgctggacccgtttcccatggtcacaccgatcagtcatcgggagggggtgcaaactccaatttgcagcaccaaagctcatgcaacatgccccagaaaaatgtcaccattcctaacgccaaaaggcttcagccatctaatgacagtgggttacaaggaagtacagcaaataatacaggcgacagagccccaatgaggacggatcaaaatcctgaaggaagcgatgcgctccaacttttccccatggctccagtgattccagacggagttccccaatctcacgacataggccagccaatgcgagctataaaagttgtgcctcacaatccaagaactgcaactgcgtcggctgctcgaattttccagtccatacaagcagagagaaaacagcaggattcaacctag

seqidno：3

indel序列：gattaccttggggttggtcaggtggagttaatgggctatggtgtttttcacgggtaag

seqidno：4

pbelf3b-indel-f:tcgttgtgttaactgttttctg

seqidno：5

pbelf3b-indel-r:ccaaacaaatccccactatg

seqidno：6

pbelf3b-gfp-f：gagaacacgggggactctagaatgaggagggggaacgag

seqidno：7

pbelf3b-gfp-r：gcccttgctcaccatggatccggttgaatcctgctgttttctc

seqidno：8

gfp-r:cgtcgtccttgaagaagatg

seqidno：9

pbelf3b-n-d-r1:agtatctgcttaggcgtgatattgatcagga

seqidno：10

pbelf3b-n-d-f2:cgcctaagcagatactttgtgactaaagcacttag

seqidno：11

pbelf3b-d+d-r1:agcccattaactccacctgaccaaccccaaggtaatccttaggcgtgatattgatcaggat

seqidno：12

pbelf3b-d+d-f2:gtggagttaatgggctatggtgtttttcacgggtaagcagatactttgtgactaaagcacttagtc

seqidno：13pbelf3b-n-d

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seqidno：14pbelf3b-d+d

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序列表

<110>南京农业大学

<120>梨pbelf3b基因的特异性分子标记及其应用

<160>14

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<210>2

<211>4111

<212>dna

<213>新疆梨(pyrussinkiangensist.t.yu)

<400>2