一种检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用与流程

本发明属于水产病原菌检测技术领域，具体地，涉及一种检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用。

背景技术：

向海洋进军，全力推动海洋经济的发展已成为我国的重要战略。广西是连接东盟的国际交通枢纽，毗邻东南亚等海产品主要的消费市场，近年来海水养殖业发展迅速。其中，石斑鱼肉质细腻，营养丰富，作为大宗名贵的海水养殖鱼类，目前国内石斑鱼养殖年产量已达13万吨以上，产业直接产值超过百亿元，经济价值极高。然而随着石斑鱼养殖密度的增加、养殖规模的扩大，近海养殖环境出现变差趋势，日益恶化的养殖水域环境导致各种病害频繁暴发，造成了巨大经济损失。其中，石斑鱼虹彩病毒是导致石斑鱼发病的主要病毒性病原，其所导致的鱼病致死率极高，被称为“海洋口蹄疫”。目前，国际上已对石斑鱼虹彩病毒进行了系统研究，主要包括流行病学调查、病原的分离鉴定、敏感细胞系构建、病毒超微结构观察和病毒的诊断技术开发等，在一定程度上揭示了石斑鱼虹彩病毒的感染和致病机理。2018年广西北海地区池塘养殖的珍珠龙胆石斑鱼中暴发疑似石斑鱼虹彩病毒病，通过对患病石斑鱼中病原微生物进行聚合酶链式反应检测技术(polymerasechainreation,pcr)分析鉴定，证明石斑鱼虹彩病毒(grouperiridovirus,sgiv)是主要致病病原。因此研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的检测技术，对于控制石斑鱼sgiv病毒的危害极其重要。但是目前针对石斑鱼sgiv病毒的诊断方法主要是普通pcr技术、巢式pcr技术、荧光定量pcr技术等。pcr技术检测结果精确可靠，但却存在操作繁琐、耗时长、仪器试剂昂贵等不足，无法满足现场快速准确检测诊断的要求。因此应着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高、可用于养殖现场的石斑鱼sgiv病毒快速检测技术和功能产品，这对于及早发现、确定病原，进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失至关重要。

核酸适配体是利用指数富集的配基系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichmenttechnology,selex)，从人工合成的随机序列文库中在体外经过多轮筛选获得的、能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸。核酸适配体具有特异性高、亲和性高、稳定性强、易化学合成和化学修饰等诸多优点。基于适配体能够高特异性识别病原微生物或病变细胞的特性，适配体被广泛用于生物传感器的构建，通过信号放大等实现对病原或疾病的精确检测诊断。目前核酸适配体作为一类新型的、广受关注的新型检测和治疗工具，在人类医学研究、疾病诊断、病毒侵染机制研究等领域展现出广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用，以实现石斑鱼虹彩病毒的高灵敏度、高特异性检测。

根据本申请的一个方面，提供一种检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体，包括seqidno.1的核苷酸序列。

优选地，包括seqidno.2的核苷酸序列。

优选地，其核苷酸序列上的至少一个核苷酸被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。

优选地，还包括有编码标志物的序列，标志物选自发光物质、生物素或酶中的一种或一种以上。

优选地，标志物为发光物质，发光物质选自羟基荧光素、异硫氰酸荧光素或羧基四甲基罗丹明中的一种或一种以上。

根据本发明的另一个方面，提供一种构建上述检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体的方法，采用selex技术，包括以下步骤：(1)建立单链dna随机文库library50，单链dna随机文库library50的核苷酸序列为：

5’-gacgcttactcaggtgtgactcg(50n)cgaaggacgcagatgaagtctc；

(2)利用感染了石斑鱼虹彩病毒的石斑鱼体细胞筛选单链dna随机文库library50，得出石斑鱼虹彩病毒的特异性dna文库；(3)以特异性dna文库作为模板，进行pcr扩增，pcr扩增采用的5’端引物包括了seqidno.3的核苷酸序列，采用的3’端引物包括了seqidno.4的核苷酸序列。

优选地，pcr扩增的扩增程序是：94℃5分钟，94℃1分钟，56℃30秒，72℃1分钟，25轮循环；72℃5分钟。

根据本发明的另一个方面，提供上述检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体在检测石斑鱼虹彩病毒中的应用。

根据本发明的另一个方面，提供一种石斑鱼虹彩病毒的荧光分子检测探针：包括上述检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体，标志物为羟基荧光素。

相对于现有的蛋白质抗体，本发明提供的检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体具有分子量小、无免疫原性、制备周期短、重现性好等优点，便于体外化学合成；而且，该核酸适配体具有较高稳定性，易于运输和保存；另外，该核酸适配体便于标记，易于对核酸适配体的不同部位进行修饰和取代。与现有的蛋白抗体相比，本发明在构建上述核酸适配体的过程中采用了selex技术，由此所得到的核酸适配体对石斑鱼虹彩病毒具有更高的亲和力和特异性；特别地，上述核酸适配体经部分取代或者经过修饰后得到核酸适配体衍生物，只要核酸适配体衍生物具有与原核酸适配体基本相同或者类似的分子结构、理化性质和功能，都可用于石斑鱼sgiv病毒的检测。在本发明提供的检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体及其衍生物的核苷酸序列中设置标志物序列，结合相应的检测手段，能够通过简单快捷的操作，实现石斑鱼虹彩病毒的高效检测。

附图说明

图1为核苷酸序列为seqidno.2的核酸适配体的二级结构预测图；

图2为实施例2中流式细胞仪检测的样品fam荧光值测试结果；

图3为实施例2中激光扫描共聚焦显微镜的观测结果：(a)试验组样品的光镜图，(b)试验组样品的荧光图，(c)(a)图和(b)图的叠加效果图，(d)对照组样品的光镜图，(e)对照组样品的荧光图，(f)(d)图和(e)图的叠加效果图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

实施例1检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体的筛选和制备

s1.随机单链dna(ssdna)文库的构建和引物的合成

构建随机ssdna文库library50，两端为固定序列，中间50个核苷酸为随机序列，其核苷酸序列如下：

5’-gacgcttactcaggtgtgactcg(50n)cgaaggacgcagatgaagtctc。采用的5’端引物的序列如下：5’-fam-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’，采用的3’端引物的序列如下：5’-biotin-gagacttcatctgcgtccttcg-3’。随机ssdna文库和引物均由上海生工生物有限公司合成。

s2.selex筛选(相当于阳性筛选)

将10nmol上述随机ssdna文库溶解在500μlpbs中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的随机ssdna文库与sgiv病毒感染的石斑鱼脾细胞在冰上孵育1h。

孵育结合完成后，离心移除上清，用10ml的经过pbs洗涤sgiv病毒感染的石斑鱼脾细胞，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清，即为特异性识别sgiv病毒感染的石斑鱼细胞的ssdna核酸文库。

s3.pcr扩增

取100μl筛选得到的识别sgiv病毒感染细胞的ssdna文库，使其与5’端引物、3’端引物进行pcr扩增。pcr反应体系如下(1000μl)：10×buffer100μl,dntpmix(2.5mm)80μl，5’端引物40μl，3’端引物40μl，ssdna文库100μl，rtaq酶12.5μl，ddh2o627.5μl。pcr的扩增程序为：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过25轮循环；72℃5min。第一轮selex筛选后得到的上清，要全部用于进行pcr扩增，扩增后得到双链核酸(dsdna)文库。

s4.ssdna文库的制备

将100μl链酶亲和素标记的磁珠与s3制得的dsdna文库在常温下孵育20min，利用dsdna上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将dsdna结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清，用2mlpbs洗涤磁珠，然后在ep管中加入200μlnaoh溶液(200mm)，常温反应10min，使dsdna变性解链，带有生物素的一条链与链亲和素结合留在磁珠上，反应完毕后利用磁性分离架回收得到上清液；将上清液加入经过无菌水洗涤后的除盐柱，在重力的作用下自然滴完。向滤液中加入500μlpbs，收集到含有ssdna文库的溶液，用于下一轮的筛选。

s5.ssdna文库的反复筛选

将s4中得到的ssdna文库代替s2中的随机ssdna文库，重复s2–s4所示的selex筛选、pcr扩增及ssdna文库的制取过程10次。

s6.阴性筛选

将s5的第二轮及第二轮以后筛选得到的ssdna文库溶解、92℃恒温水浴，与石斑鱼正常细胞在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液，上清溶液即为经过阴性筛选的ssdna文库。

本步骤采用石斑鱼正常细胞为对照，将s5后筛选得到的ssdna文库进行阴性筛选以提高ssdna文库的筛选效率。

s7.11轮筛选

将s6中收集到的上清液，经过s3的pcr扩增和s4的ssdna文库制备后，依次重复进行s6、s2、s3和s4的过程，利用流式细胞仪检测所得ssdna文库对sgiv病毒感染细胞识别能力的变化情况，重复进行11轮筛选，所得到的ssdna文库对sgiv病毒感染细胞识别能力达到最强。将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到可用于检测sgiv病毒感染细胞的ssdna核酸适配体，其核苷酸序列为：

gcaaccatcctccccaatgtatagttcctttttagatcactaatgccacc(seqidno.1)，

或，

gacgcttactcaggtgtgactcggcaaccatcctccccaatgtatagttcctttttagatcactaatgccacccgaaggacgcagatgaagtctc(seqidno.2)。

利用mfold软件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/dna-folding-form)在线预测核苷酸序列为seqidno.2的核酸适配体的二级结构，预测结果如图1所示，其形成特殊的茎环结构和发卡结构，其吉布斯自由能(δg)为-18.81。类似地，核苷酸序列为seqidno.1的ssdna核酸适配体也形成特殊的茎环结构和发卡结构。

实施例2

2.1主要仪器

attunenxt流式细胞仪(赛默飞世尔科技)、fv3000激光扫描共聚焦显微镜(奥林巴斯)。

2.2实验操作

利用羟基荧光素(fam)分别标记实施例1构建的seqidno.2核酸适配体。

试验组：将10nmolfam标记的seqidno.2核酸适配体在500μlpbs中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的fam标记的seqidno.2核酸适配体与sgiv病毒感染的石斑鱼脾细胞在冰上孵育1h，孵育结合完成后，离心移除上清。

对照组：将10nmolfam标记的seqidno.2核酸适配体在500μlpbs中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的fam标记的seqidno.2核酸适配体与正常的石斑鱼脾细胞在冰上孵育1h，孵育结合完成后，离心移除上清。

分别利用流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜检测试验组和对照组经过孵育所得到的细胞沉淀物。

2.3实验结果

流式细胞仪的检测结果如图2所示，与对照组中流式细胞仪检测到的正常石斑鱼脾细胞表面的荧光值相比，试验组中流式细胞仪检测到sgiv病毒感染的石斑鱼脾细胞表面的荧光值显著升高，即fam标记的seqidno.2核酸适配体对sgiv病毒感染细胞具有高特异性识别能力。

激光扫描共聚焦显微镜的检测结果如图3所示，结果证实，与对照组中正常细胞相比，试验组中的sgiv病毒感染细胞的荧光效果明显，试验组中的细胞样品发出强烈的绿光。说明，fam标记的seqidno.2核酸适配体明显结合在sgiv病毒感染的石斑鱼脾细胞表面，即fam标记的seqidno.2核酸适配体对sgiv病毒感染细胞具有高特异性识别能力。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>广西科学院，广西壮族自治区海洋研究所

<120>一种检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcaaccatcctccccaatgtatagttcctttttagatcactaatgccacc50

<210>2

<211>95

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gacgcttactcaggtgtgactcggcaaccatcctccccaatgtatagttcctttttagat60

cactaatgccacccgaaggacgcagatgaagtctc95

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gacgcttactcaggtgtgactcg23

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gagacttcatctgcgtccttcg22