一种基于柑橘原生质体的高效检测蛋白质亚细胞定位方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于柑橘原生质体的高效检测蛋白质亚细胞定位方法。

背景技术：

柑橘是世界第一大果树，也是我国南方最重要的果树。由于柑橘基因组高度杂合，遗传背景复杂，并具有童期长、多胚等特性，阻碍了柑橘基因功能研究进展。随着基因组学发展和测序技术进步，多个柑橘基因组已测序完成，鉴定了越来越多的柑橘基因。蛋白质是基因表达产物，蛋白质结构与功能同其亚细胞定位有着紧密联系，蛋白质必须处于特定位置才能发挥基因功能。因此，检测蛋白质亚细胞定位是研究基因功能的必要步骤。

早期多年生木本植物柑橘的瞬时表达体系不成熟，需要借助模式植物烟草或拟南芥的原生质体，检测柑橘蛋白质亚细胞定位。由于物种不一致，在模式植物细胞中检测柑橘蛋白质亚细胞定位不及在柑橘细胞的定位结果可靠。

现在采用的在柑橘细胞检测蛋白质亚细胞定位方法为质粒共转化法，即将细胞器荧光蛋白标记质粒和待测基因荧光标记质粒共转入柑橘原生质体，使两种质粒在细胞内共同表达，该方法在拟南芥、烟草等模式植物的原生质体成功率较高，但在多年生木本植物柑橘的成功率较低，难以获得两种质粒共转化的细胞。同时，采用传统的共转化方法，每次检测蛋白亚细胞定位均需中量抽提对应的细胞器荧光蛋白标记质粒，质粒抽提试剂耗费较大。而且，由于不同表达载体表达情况不一样，共转成功的细胞也难以观察到两种荧光完全重合。即在一种荧光蛋白表达较好的情况下，另一种荧光蛋白基因表达相对慢一些，荧光蛋白信号较弱，需要重复几次，观察更多的细胞，才能观察到荧光信号表达水平一致的细胞。由此可见，传统的检测柑橘蛋白质亚细胞定位的方法过程复杂、成功率低、费时费力、成本较高。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供了一种基于柑橘原生质体的高效检测蛋白质亚细胞定位方法，利用柑橘稳定遗传转化与瞬时转化相结合。分两步进行，利用柑橘稳定遗传转化创制稳定表达细胞器荧光蛋白标记的柑橘材料，使用获得的稳定表达细胞器荧光蛋白标记的柑橘材料分离原生质体，细胞器荧光蛋白标记已稳定表达于获得的原生质体，只需将待测基因荧光标记载体单转入前面所述原生质体瞬时表达，培养24-48h后，激光共聚焦显微镜下观察。两种荧光重合则表明待测基因表达产物定位于该细胞器。该方法仅需要瞬时转化一个质粒，即可检测柑橘蛋白质亚细胞定位，简单、便捷、高效、节约成本。同时，创制的稳定表达细胞器荧光蛋白标记的柑橘材料(愈伤组织细胞系、再生植株等)能长期保存，可以无限次的用于检测柑橘蛋白质亚细胞定位。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于柑橘原生质体的高效检测柑橘蛋白质亚细胞定位方法，包括以下步骤：

(1)将带有细胞器标记荧光蛋白(细胞器定位标签与荧光蛋白基因融合，由同一个启动子驱动表达)的细胞器荧光蛋白标记载体转化农杆菌，获得重组农杆菌；

(2)重组农杆菌侵染柑橘外植体，获得表达细胞器标记荧光蛋白的柑橘材料；

(3)将待测基因克隆至荧光不同于步骤(1)的荧光标记表达载体(待测基因与荧光蛋白基因融合，由同一个启动子驱动表达)，获得待测基因荧光标记载体；

(4)酶解步骤(2)获得的柑橘材料，分离纯化并获得表达细胞器荧光蛋白标记的柑橘原生质体；

(5)通过peg介导，将待测基因荧光标记载体转化步骤(4)获得的柑橘原生质体，培养24-48h后，激光共聚焦显微镜下观察，两种荧光标记重合则表明待测基因表达蛋白定位于该细胞器。

进一步地，步骤(1)所述的载体是可以表达包含定位于不同细胞器的荧光融合蛋白质粒，由同一个启动子驱动表达。步骤(3)所述的待测基因荧光标记表达载体包含待测基因与荧光蛋白基因融合，由同一个启动子驱动表达。

优选的，步骤(1)所述的农杆菌菌株是eha105。

优选的，步骤(5)得到的柑橘原生质体用w5溶液将其密度调为2×10⁶/ml；步骤(6)为：取20μg待测基因荧光标记载体加入到100μl步骤(5)的密度为2×10⁶/ml的柑橘原生质体溶液中，再加入110μl聚乙二醇-钙溶液，静置20min，洗脱溶液，用wi溶液重悬原生质体，28℃暗培养24-48h后，激光共聚焦显微镜下观察。所述的聚乙二醇-钙溶液优选含质量分数40％的聚乙二醇、0.8m甘露醇和0.2mcacl2；所述的聚乙二醇的分子量为4k。

本发明利用柑橘稳定遗传转化与瞬时转化相结合，大幅提高检测柑橘蛋白质亚细胞定位的成功率，简单、便捷、高效、节约成本，为柑橘基因功能研究提供了良好的技术平台。与现有技术相比，本发明具有如下有益的效果：

(1)本发明的检测柑橘蛋白质亚细胞定位方法中，通过柑橘稳定遗传转化与瞬时转化相结合，利用柑橘稳定遗传转化创制稳定表达细胞器荧光蛋白标记的柑橘材料，检测柑橘蛋白质亚细胞定位仅需要瞬时转化一个质粒，一次可成功，大幅提高了检测柑橘蛋白质亚细胞定位的成功率。

(2)创制稳定表达细胞器荧光蛋白标记的材料能长期保存，可以无限次的用于检测柑橘蛋白质亚细胞定位。创制一套稳定表达各种细胞器荧光蛋白标记的柑橘材料并保存，可长期用于检测柑橘各类基因表达产物蛋白质的亚细胞定位，为柑橘基因功能研究提供了便捷的技术。

(3)用于亚细胞定位的柑橘稳定遗传转化与瞬时转化相结合的方法也可用于双分子荧光互补、验证crisprgrna的效果等实验，为柑橘育种提供了便捷高效的技术。

附图说明

图1是实施例1稳定表达线粒体定位红色荧光蛋白标记载体mt-rb的结构图。

图2是实施例1亚细胞定位载体pm999-gfp的载体结构图，酶切位点xbai位置是待测基因coxii所连接位点。

图3是实施例1‘国庆一号’温州蜜柑(g1)愈伤组织稳定表达线粒体定位红色荧光标签基因在体式显微镜下观察图，a图是荧光效果图，b图是明场效果图。

图4是实施例1稳定表达线粒体定位红色荧光标签的原生质体在激光共聚焦显微镜下亚细胞观察效果图，a图是荧光效果图，b图是原生质体明场观察效果图。

图5是实施例1分离纯化‘g1’愈伤组织原生质体后，检测原生质体活性在倒置显微镜下观察效果图，a图是荧光效果图，b图是明场效果图。

图6是实施例1将质粒mt-rb和质粒pm999-gfp-coxii共同转入‘g1’愈伤组织原生质体后，倒置显微镜下观察效果图，a图是红色荧光观察效果图，b图是绿色荧光观察效果图，c图是明场观察结果图。

图7是实施例1分离纯化稳定表达线粒体定位红色荧光标签基因的‘g1’愈伤组织原生质体在倒置显微镜下观察效果图，a图是明场效果图，b图是荧光效果图，c图是a图与b图重合效果图。

图8是实施例1本发明单转一种质粒的方式，将质粒pm999-gfp-coxii转入稳定表达线粒体定位红色荧光标签蛋白的‘g1’愈伤组织原生质体后，倒置显微镜下观察效果图，a图是红色荧光观察效果图，b图是绿色荧光观察效果图，c图是明场观察结果图。

图9是相同条件下柑橘基因亚细胞定位传统共转两种质粒方式与本发明所述单转一种质粒方式的结果比较柱形图。

图10是实施例中原生质体转化后激光共聚焦显微镜下观察结果图，a图是红色荧光观察效果图，b图是绿色荧光观察效果图，c图是明场观察效果图，d图是图a、图b与图c三通道重合效果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本实施例涉及柑橘愈伤组织稳定遗传转化，柑橘愈伤组织原生质体转化。愈伤组织稳定遗传转化载体为携带线粒体定位红色荧光蛋白rfp(redfluorescentprotein)的融合载体(线粒体定位标签与红色荧光蛋白融合，由同一个启动子驱动表达)，载体图谱详见图1，载体抗性为除草剂basta抗性，记为mt-rb(nelsonbk,caix,andreasnebenführ.amulti-colorsetofinvivoorganellemarkersforcolocalizationstudiesinarabidopsisandotherplants[j].theplantjournal,2007,51(6):1126-1136.)。所克隆的待测基因coxii表达产物定位于线粒体上，所用绿色荧光标记gfp(greenfluorescentprotein)表达亚细胞定位载体pm999-gfp来自华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻研究团队，载体图谱详见图2。用于稳定遗传转化的柑橘愈伤组织为‘国庆一号’温州蜜柑(简称‘g1’)，来自华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室柑橘研究团队。具体包括如下步骤：

一、创制稳定表达线粒体定位rfp的柑橘愈伤组织：

a、将线粒体定位rfp表达载体转入农杆菌菌株eha105，获得重组农杆菌。

b、用mt悬浮培养基建立‘g1’愈伤组织悬浮细胞系，悬浮4-5d。

c、制备重组农杆菌菌液，将其od600值调为0.6-0.8，加入乙酰丁香酮as(50mg/l)。

d、弃去愈伤组织悬浮细胞系上清液，‘g1’愈伤组织于带滤纸的皿(无菌)沥干水分，转移至步骤c中制备好的农杆菌菌液，常温150rpm摇5min，静置20min。

e、同步骤d弃上清液，滤干菌液，将侵染后的愈伤组织转移至cm固体培养基(mt固体培养基+50mg/las抗生素)，平铺一层，23℃恒温暗培养箱中共培养3d。

f、3d后将愈伤组织转移至sm培养基(mt固体培养基+400mg/lcef头孢+30μmol/lbasta)，28℃暗培养箱中培养，约30d后长出抗性愈伤组织，挑出带红色荧光的抗性愈伤组织，纯化、扩繁，保存于mt固体培养基中，记为g1-mt-rb。阳性愈伤的显微观察图见图3。

g、进一步酶解、分离纯化原生质体，共聚焦显微镜下观察荧光蛋白表达情况，验证其在线粒体中表达，结果见图4，可以看到红色荧光成功在线粒体中表达，表明阳性愈伤组织细胞成功稳定表达线粒体定位红色荧光蛋白。

二、构建待测基因荧光标记载体pm999-gfp-coxii

a、以柑橘cdna为模板，采用引物coxii-f和coxii-r通过pcr扩增待测基因coxii。

coxii-f：gcagatctatcgattctagataatagacttacatcacgat，

coxii-r：cctttgcccatggctctagaccatagtaaactccttct。

b、用限制性内切酶xbai酶切载体pm999-gfp，胶回收并获得线性化载体，用同源重组酶将待测基因coxii连接至线性化载体中，得到待测基因荧光标记载体pm999-gfp-coxii。

c、将载体pm999-gfp-coxii转化大肠杆菌，冰上30min，42℃热激90s，涂皿，得到重组大肠杆菌。

d、挑单克隆，摇菌3-4h，测序验证是否连接成功，吸约10μl连接成功的重组大肠杆菌菌液至100ml新鲜lb培养基中，摇8-12h。

e、用中量抽提试剂盒qiagenplasmidmidikit(catno.12143)抽提质粒，得到浓度约为2μg/μl的质粒pm999-gfp-coxii。

三、原生质体瞬时转化：

(1)传统共转两种质粒方式

a、建立‘g1’愈伤组织悬浮细胞系，用长吸管吸取大约1g悬浮培养物于50ml小三角瓶，吸干培养基，加入1ml0.6mol/leme培养基，再加入1ml酶液；于低速恒温摇床上培养过夜(40rpm，28℃，15h)。

所述的0.6mol/leme溶液包含mt基本培养基、0.6mol/l蔗糖及500mg/l麦芽提取物，调ph至5.8；所述的酶液含1.2％纤维素酶(celluloser-10)、1.2％离析酶(macerozymer-10)、12.8％甘露醇、0.12％(n-吗啉)乙磺酸-水合物、0.36％cacl2·2h2o、以及0.11％nah2po4。

b、酶解后的原生质体经45μm的不锈钢网过滤，去除渣质。过滤物离心(100×g)5min后，弃上清液。沉淀物用13％甘露醇-25％蔗糖介面法离心(100×g)3min，用吸管将两液面间的原生质体移出，用w5溶液洗涤1次，离心(100×g)5min后，用w5溶液将原生质体密度调为2×10⁶个/ml；

所述的13％甘露醇溶液含kh2po40.0272g/l、kno30.1g/l、mgso40.25g/l、ki0.0002g/l、cuso40.000003g/l、cacl20.15g/l、甘露醇130g/l；所述的25％蔗糖溶液含kh2po40.0272g/l、kno30.1g/l、mgso40.25g/l、ki0.0002g/l、cuso40.000003g/l、cacl20.15g/l、蔗糖250g/l；所述的w5溶液含154mmnacl、125mmcacl2、5mmkcl和2mmmes，ph调至5.8。

c、使用荧光素双醋酸酯fda(5mg/ml，丙酮配制)染色‘g1’愈伤组织原生质体，于荧光显微镜下检查原生质体活性(发荧光原生质体数/观察原生质体总数×100％)，原生质体活力98％以上方可继续用于后续原生质体转化。如图5，所分离纯化得到的‘g1’愈伤组织原生质体活力99％以上，可以用于后续的原生质体转化实验。

d、取100μl制备好的g1愈伤组织的原生质体，分别加入约20μg中量提取法获得的质粒mt-rb和pm999-gfp-coxii，再加入110μl聚乙二醇-钙(peg-cacl2)溶液，静置20min。

所述的聚乙二醇-钙溶液含质量分数40％的聚乙二醇、0.8m甘露醇和0.2mcacl2；所述的聚乙二醇的分子量为4k。

e、加入w5溶液洗脱2次，用300-500μlwi溶液重悬转化后的原生质体，28℃暗培养箱培养。

所述的wi溶液含0.7m甘露醇、4mmmes和4mmkcl，ph调至5.8。

f、24-48h后，倒置显微镜下观察两种质粒转化情况，如图6所示，两种荧光重合原生质体百分率约3.18％。

g、于激光共聚焦显微镜下观察结果，若绿色荧光gfp能与红色荧光rfp完全重合，则表明该基因定位于线粒体上，反之则不是定位于线粒体上。

(2)本发明单转一种质粒方式

下面所用溶液配方均与传统共转两种质粒方式所用溶液一致。

a、建立稳定遗传转化材料g1-mt-rb悬浮细胞系，用长吸管吸取大约1g悬浮培养物于50ml小三角瓶中，吸干培养基，加入1ml0.6mol/leme培养基，再加入1ml酶液；于低速恒温摇床上培养过夜(40rpm，28℃，15h)。

b、酶解后的原生质体经45μm的不锈钢网过滤，去除渣质。过滤物离心(100×g)5min后，弃上清液。沉淀物用13％甘露醇-25％蔗糖介面法离心(100×g)3min，用吸管将两液面间的原生质体移出，用w5溶液洗涤1次，离心(100×g)5min后，用w5溶液将原生质体密度调为2×10⁶个/ml。

如图7所示，所分离纯化得到的稳定遗传转化材料g1-mt-rb的原生质体有99.5％以上细胞正常表达rfp，即99.5％以上细胞有活性，可用于后续原生质体转化实验。

c、取100μl制备好的g1-mt-rb的原生质体，加入20μg中量提取法获得的质粒pm999-gfp-coxii，再加入110μl聚乙二醇-钙(peg-cacl2)溶液，静置20min。

d、加入w5溶液洗脱2次，用300-500μlwi溶液重悬转化后的原生质体，于28℃暗培养箱培养；

e、24-48h后于倒置显微镜下观察质粒转化情况，如图8，两种荧光重合原生质体百分率约65.78％。如图9所示，本发明转化方式与传统共转方式相比效率大大提高。

f、于激光共聚焦显微镜下观察结果，若绿色荧光gfp能与红色荧光rfp完全重合，则表明该基因定位于线粒体上，反之则不是定位于线粒体上，如图10，待测柑橘基因coxi绿色荧光载体表达产物同线粒体定位红色荧光标记载体表达产物一样定位于线粒体中，且两种荧光能完全重合变成黄色荧光，表明该柑橘基因表达产物定位于线粒体上。

相同转化条件下，两种转化方式中两种荧光重合原生质体百分率比较柱形图如图9所示，表明本发明方法简单、便捷、高效、成本低，成功率大幅提高。

本领域的技术人员容易理解，目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明内容并据以实施，以上所述仅为本发明的较佳实施例之一，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种基于柑橘原生质体的高效检测蛋白质亚细胞定位方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcagatctatcgattctagataatagacttacatcacgat40

<210>2

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cctttgcccatggctctagaccatagtaaactccttct38