半乳糖苷-四苯乙烯类化合物及其制备方法以及其作为药物载体的应用与流程

本发明属于化学技术领域，具体涉及一种半乳糖苷-四苯乙烯类化合物及其制备方法，以及其作为药物载体的应用。

背景技术：

化疗是癌症治疗不可缺少的方法，但传统化疗药物的药代动力学差，缺乏肿瘤靶点，限制了其临床应用。

为了提高化疗药物的靶向性和药代动力学特性，纳米药物载体被广泛用作药物递送系统(ddss)来以此来改善化疗药物的疗效。例如脂质体，胶束，纳米凝胶，囊泡和无机材料等纳米药物载体，可以通过高通透性和滞留效应(epr)被动靶向到病灶部位，从而降低药物向非特异性细胞或组织的生物分布以减少副作用的发生，并且在一定程度上还能避免机体对药物的快速代谢或清除作用。

近年来，两亲性嵌段共聚物作为药物递送系统在癌症治疗中的应用受到了越来越广泛的关注，两亲性嵌段共聚物在选择性溶剂中可自组装成双分子层、胶束或囊泡，具有改善稳定性，增加生物利用度，增强通透性和保留效果等诸多优点。

糖类化合物参与多种生物进程，是激素、酶、毒素、凝集素、抗体、病毒和细菌等受体蛋白识别的关键分子。半乳糖凝集素属于凝集素家族中的一种，它可以通过一个严格的半乳糖苷识别域与半乳糖苷特异性的结合，由于半乳糖凝集素广泛表达于实体肿瘤细胞膜，如大肠、肺、乳腺、胰腺、肝脏、甲状腺和血液系统等恶性肿瘤的细胞膜中，因此，在两亲性嵌段共聚物中引入半乳糖苷并以此作为药物递送系统，利用半乳糖苷靶向半乳糖凝集素，以此提高药物的靶向性在理论上是可行性。同时，由于半乳糖苷酶在多种癌症亚型中具有高表达，如肝脏，肺，卵巢等恶性肿瘤中均有较高表达，因此，还可利用恶瘤肿瘤中高表达的半乳糖苷来激活各种半乳糖苷药物输送系统，以此提高药物的靶向性和药代动力性能。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种引入有半乳糖苷的两亲性嵌段共聚物半乳糖苷-四苯乙烯类化合物(tpe-gal)，该化合物可通过透析法方便地自组装成均匀而坚固的囊泡，作为药物递送系统，具有优良的荧光性能、靶向性能和药代动力学性能。

本发明的另一个目的在于提供所述引入有半乳糖苷的两亲性嵌段共聚物半乳糖苷-四苯乙烯类化合物(tpe-gal)的制备方法。

本发明的再一个目的在于提供所述引入有半乳糖苷的两亲性嵌段共聚物半乳糖苷-四苯乙烯类化合物(tpe-gal)的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

1.本发明公开了一种半乳糖苷-四苯乙烯类化合物，具有如下所示的结构：

2.本发明公开了该半乳糖苷-四苯乙烯类化合物的制备方法，所述制备方法的合成路线如下：

所述制备方法包括的步骤如下：

s1:制备化合物1：以1,2,3,4,6-五-o-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖和炔丙醇为原料，在三氟化硼乙醚的作用下反应制得化合物1；

s2:制备化合物2：以4-羟基二苯甲酮和1,6-二溴己烷为原料，在碱性化合物的作用下进行单取代反应制得化合物2；

s3:制备化合物3：以化合物2为原料，在锌粉和四氯化钛的作用下反应制得化合物3；

s4:制备化合物4：以化合物3为原料与叠氮化合物进行取代反应制得化合物4；

s5:制备化合物5：以化合物1和化合物4为原料，在抗坏血酸钠和五水硫酸铜作用下反应制得化合物5；

s6:制备半乳糖苷-四苯乙烯类化合物tpe-gal：以化合物5为原料，在碱性条件下脱去乙酰基保护基团制得半乳糖苷-四苯乙烯类化合物tpe-gal。

3.本发明还公开了该半乳糖苷-四苯乙烯类化合物作为药物载体的应用。

在该半乳糖苷-四苯乙烯类化合物作为药物载体的应用中，优选地将该半乳糖苷-四苯乙烯类化合物作为抗肿瘤药物的药物载体。

在将该半乳糖苷-四苯乙烯类化合物作为抗肿瘤药物的药物载体的应用中，优选地将该半乳糖苷-四苯乙烯类化合物自组装成囊泡作为抗肿瘤药物的负载囊泡。

在将该半乳糖苷-四苯乙烯类化合物自组装成囊泡作为抗肿瘤药物的负载囊泡的应用中，优选地将该半乳糖苷-四苯乙烯类化合物制备成囊泡作为阿霉素dox的负载囊泡。

本发明还公开了一种含有该半乳糖苷-四苯乙烯类化合物的载药系统，所述载药系统包含有该半乳糖苷-四苯乙烯类化合物和治疗有效量的抗肿瘤药物。

本发明的载药系统，完全可以直接由该半乳糖苷-四苯乙烯类化合物和药物组成，能够达到本发明的有益效果，但优选在载药系统中加入药学辅料，可以得到更优的载药系统。

本发明的有益效果为：本发明所述半乳糖苷-四苯乙烯类化合物以tpe为疏水实体，以半乳糖为亲水实体，通过三氮唑结合而成，利用疏水实体四苯乙烯(tpe)的聚集诱导发光效应可构建多功能体系的成像，可实现可视化的药物转运，利用亲水实体半乳糖的靶向作用，可实现药物的靶向递送，同时，该半乳糖苷-四苯乙烯类化合物可通过透析法方便地自组装成均匀而坚固的囊泡，自组装形成的囊泡还具有良好的分散性能和良好的载药性能，可以使抗癌药物具有更加优良的药代动力学特性，在药物控释和肿瘤靶向治疗方面具有潜在的应用前景。本发明公开的所述半乳糖苷-四苯乙烯类化合物的制备方法，反应条件温和，所用试剂均为工业常用试剂，适合大量工业化制备，具有良好的商业化应用价值。

附图说明

图1为tpe-gal(10μm)在dmso/h2o混合溶剂中的荧光性能测试结果图；

图2为tpe-gal囊泡的透射电镜和动态光散射表征结果图；其中，a为tpe-gal囊泡的高分辨透射电子显微镜表征图，b为tpe-gal囊泡的粒径分布图，c为tpe-gal囊泡的zeta电位图；

图3为tpe-gal@dox载药囊泡透射电镜和动态光散射表征结果图；其中，a为tpe-gal@dox载药囊泡的高分辨透射电子显微镜表征图，b为tpe-gal@dox载药囊泡的粒径分布图，c为tpe-gal@dox载药囊泡的zeta电位图；

图4为紫外吸收光谱、红外光谱和dsc表征结果图；其中，a为dox，tpe-gal@dox载药囊泡和tpe-gal囊泡的紫外吸收图谱，b为dox，tpe-gal@dox载药囊泡和tpe-gal囊泡的红外图谱；c为dox,tpe-gal@dox载药囊泡和tpe-gal囊泡的dsc图谱；

图5为hepg2细胞和l02细胞对tpe-gal@dox载药囊泡吞噬行为及胞内dox控制释放行为考察图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1制备半乳糖苷-四苯乙烯类化合物

1.制备化合物1

取1,2,3,4,6-五-o-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖(2.0mmol)溶解于干燥二氯甲烷中，氮气保护下，0℃滴加炔丙醇(3.0mmol)，然后滴加三氟化硼乙醚(3.6mmol)，室温反应过夜。反应结束，加入碳酸钾(200mg)搅拌30分钟淬灭反应，过滤，滤液加水，二氯甲烷萃取3次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂。浓缩物经柱层析分离得到目标化合物1，白色固体，产率为85％。

¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ5.40(s,1h),5.22(t,j＝9.2hz,1h),5.06(d,j＝10.4hz,1h),4.74(d,j＝8.4hz,1h),4.38(s,2h),4.22-4.16(m,1h),4.14-4.11(m,1h),3.94(t,j＝6.6hz,1h),2.46(s,1h),2.15(s,3h),2.07(s,3h),2.05(s,3h),1.99(s,3h).

2.制备化合物2

取4-羟基二苯甲酮(2.52mmol)，1,6-二溴己烷(7.56mmol)和碳酸钾(1.045g)溶解于15ml丙酮溶液中。加热回流过夜，反应结束冷却至室温，过滤。取滤液减压蒸馏除去溶剂，浓缩物经柱层析分离得到目标化合物2，白色固体，产率为82％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.82(d,j＝8.8hz,2h),7.75(d,j＝7.2hz,1h),7.56(t,j＝7.4hz,1h),7.47(t,j＝7.4hz,1h),6.95(d,j＝8.8hz,1h),4.05(t,j＝6.4hz,1h),3.43(t,j＝6.8hz,1h),1.82-1.92(m,4h),1.57-1.49(m,4h).

3.制备化合物3

取化合物2(1mmol)和锌粉(2.2mmol)溶解于5ml干燥四氢呋喃中，冷却至-78℃，氮气保护下加入四氯化钛(1.5mmol)，继续保持-78℃搅拌1小时，然后加热回流过夜。待反应结束过滤，滤液经减压蒸馏除去溶剂，浓缩物经柱层析分离得到目标化合物3，淡黄色液体，产率为81％。

¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.14-6.99(m,10h),6.93-6.88(m,4h),6.64-6.59(m,4h),3.90-3.86(m,4h),3.43-3.40(m,4h),1.90-1.87(m,4h),1.75-1.73(m,4h),1.49-1.48(m,8h).

hrms(esi),m/zcalcd.forc38h43br2o2([m+h]+)689.1624,found:689.1624.

4.制备化合物4

取化合物3(0.5mmol)溶解于干燥dmf(10ml)中，加入叠氮钠(1.5mmol)和氯化铵(0.75mmol)，加热至85℃搅拌过夜。待反应结束，将反应体系倒入30ml水中，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂。浓缩物经柱层析分离得到目标化合物4，淡黄色液体，产率为89％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.17-7.01(m,10h),6.98-6.92(m,4h),6.68-6.62(m,4h),3.93-3.87(m,4h),3.32-3.28(m,4h),1.81-1.76(m,4h),1.68-1.63(m,4h),1.52-1.45(m,8h).

hrms(esi),m/zcalcd.forc38h43n6o2([m+h]+)615.3442,found:615.3443.

5.制备化合物5

取化合物1(0.8mmol)和化合物4(0.4mmol)溶解于水和四氢呋喃(水和四氢呋喃的体积比为1:1,10ml)的混合溶剂中，加入抗坏血酸钠(0.2mmol)和五水硫酸铜(0.4mmol)，避光65℃搅拌4小时。待反应结束，减压蒸馏除去四氢呋喃，然后加入乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，浓缩物经柱层析分离得到目标化合物5，淡黄色油状液体，产率88％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.49(d,j＝3.5hz,2h),7.13-6.94(m,10h),6.94-6.82(m,4h),6.57(m,4h),5.37(d,j＝2.0hz,2h),5.27-5.13(m,2h),5.00(dd,j＝10.4,2.8hz,2h),4.93(d,j＝12.6hz,2h),4.78(d,j＝12.6hz,2h),4.64(d,j＝7.8hz,2h),4.32-4.30(m,4h),4.19-4.08(m,4h),3.93(t,j＝6.6hz,2h),3.83(dd,j＝13.8,7.0hz,4h),2.14(s,6h),2.05(s,6h),1.98(s,6h),1.97(s,6h),1.99-1.88(m,4h),1.72-1.67(m,4h),1.49-1.46(m,4h),1.38-1.35(m,4h).

¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ170.59,170.12,169.38,169.30,157.21,144.18,143.95,139.45,136.15,132.40,131.25,127.53,126.03,122.49,113.31,99.73,72.61,72.61,71.06,68.13,67.19,62.89,61.67,50.17,30.12,28.93,26.15,25.46,20.68,20.58,20.52.

hrms(esi),m/zcalcd.forc72h86n6nao22([m+na]+)1409.5687,found:1409.5665.

6.制备半乳糖苷-四苯乙烯类化合物tpe-gal

取化合物5于圆底烧瓶中，加入10ml甲醇溶解，室温条件下滴加1mol/l的甲醇钠溶液调节ph为8-9。tlc监测原料反应完全后，加入酸性树脂调节ph约为7，过滤，减压蒸馏除去溶剂，浓缩物经薄层柱层析分离得到产物为淡黄色泡沫状固体，产率45％。

¹hnmr(400mhz,meod)δ8.00(s,2h),7.14-7.02(m,6h),7.04-6.93(m,4h),6.94-6.81(m,4h),6.69-6.54(m,4h),4.96(d,j＝12.4hz,2h),4.78(d,j＝12.4hz,2h),4.40(t,j＝7.0hz,4h),4.33(dd,j＝7.6,1.6hz,2h),3.91-3.81(m,6h),3.81-3.66(m,4h),3.61-3.51(m,4h),3.4-3.44(m,2h),2.00-1.85(m,4h),1.75-1.69(m,4h),1.52-1.47(m,4h),1.39-1.34(m,4h).

¹³cnmr(150mhz,meod)δ158.9,145.7,145.6,141.1,137.5,137.5,133.6,132.4,128.7,127.3,125.3,114.6,103.6,78.0,77.9,75.0,71.6,68.6,63.0,62.7,61.3,31.2,27.2,26.6.

hrms(esi),m/zcalcd.forc56h70n6nao14([m+na]+)1073.4842,found:1073.4833.

实施例2tpe-gal囊泡的制备和性能研究

1.tpe-gal聚集诱导发光(aie)性能测试

通过向tpe-gal的良溶剂dmso中不断加入不良溶剂水来研究其aie特性。取半乳糖苷-四苯乙烯类化合物2.6mg溶解与25mldmso溶液中，配成100μm的储备液。接着分别取0.5ml的储备液置于5ml的比色管中，分别加入2.0、1.5、1.0、0.5、0ml的dmso溶液，然后加纯化水至刻度，混合均匀，即得到含水比例分别为50％、60％、70％、80％、90％的tpe-gal混合溶液。将混合液转移到石英比色皿中，室温，激发波长λex为330nm，扫描范围为200～600nm，测量荧光性能，测试结果如图1所示。

由图1可知，激发波长为330nm时，在dmso中，tpe-gal(10μm)表现出极弱的荧光，最大峰通常位于390nm处。然而，随着水的比例的增加，荧光发射强度显着增加，特别是当水的比率大于60％时，荧光强度显著增强，最大发射峰变宽并红移至473nm。当水分率达到90％时，tpe-gal的荧光强度比100％dmso强90倍以上。这些结果表明，tpe-gal具有典型的aie特征，四苯乙烯部分的分子内旋转被阻断，导致荧光增强。

2.tpe-gal囊泡的制备和表征

采用透析法制备tpe-gal囊泡。取储备液0.35ml用dmso稀释至1.75ml，置于磁力搅拌器上边搅拌边滴加纯化水1.75ml。滴加完毕，继续搅拌1小时，然后将混合液转移到透析袋中，两端封闭后，至于100ml纯化水中透析。每隔6小时换一次纯化水，共透析24小时。透析结束，冷冻干燥得到tpe-gal囊泡固体。用透射电镜和动态光散射(dls)对制得的tpe-gal囊泡进行表征，结果如图2所示。

由图2可知，透射电镜结果显示tpe-gal囊泡的形貌为表面光滑，呈空心球形(图2a)。动态光散射(dls)分析表明，tpe-gal囊泡的平均粒径和多分散性指数(pdi)分别为157.4±7.69nm和0.074，揭示出囊泡在水溶液中分散性良好并没有显著的聚合(图2b)。tpe-gal囊泡的zeta电位是-25±2.3mv(图2c)。

实施例3负载阿霉素囊泡的制备和性能研究

1.负载阿霉素囊泡的制备和表征

作为一种新型的空心球形囊泡，进一步研究囊泡的承载药物的能力具有重要意义。选择阿霉素dox作为模型抗肿瘤药物，采用硫酸铵梯度法制备了负载dox的tpe-gal囊泡(tpe-gal@dox)，并采用透析法去除没有进入囊泡的dox。

具体制备方法为：取半乳糖苷-四苯乙烯类化合物26mg溶解与25mldmso溶液中，配成1mm的储备液。取储备液0.35ml用dmso稀释至1.75ml，置于磁力搅拌器上边搅拌边滴加硫酸铵溶液1.75ml。滴加完毕，继续搅拌1小时，然后将混合液转移到透析袋中，两端封闭后，至于100ml纯化水中透析。每隔6小时换一次纯化水，共透析24小时，得到空白囊泡。将盐酸阿霉素水溶液(5mg/ml)加入空白囊泡中，50℃孵育3小时，期间不断震摇。然后在将混合物至于透析袋中透析24小时除去没有包载的阿霉素。透析结束，冷冻干燥得到固体载药囊泡tpe-gal@dox。利用透射电镜和动态光散射(dls)对制得的tpe-gal@dox载药囊泡进行了表征，结果如图3所示。

由图3可知，透射电镜结果显示载药的tpe-gal囊泡呈球形(图3a)，动态光散射(dls)分析表明，tpe-gal@dox囊泡在水溶液中分散良好，直径165.2±8.31nm(图3b)，zeta电位-17.1±4.4mv(图3c)。

为了进一步证明囊泡上装载了dox和以及囊泡的装载能力，利用紫外吸收光谱和红外光谱分别对dox、tpe-gal囊泡和tpe-gal@dox囊泡进行了研究，结果如图4a和4b所示。根据dox在480nm处的特征吸光度峰，确定了tpe-gal@dox囊泡的承载性能。tpe-gal@dox囊泡具有良好的dox装载能力，载药量(dlc)为15.4wt％，包封率(ee)为88.5％。结果表明，tpe-gal囊泡具有良好的载药能力。

为了进一步证明囊泡上装载了dox，采用dsc方法检测了dox在tpe-gal@dox囊泡中的分布状态，结果如图4c所示，结果有力地证明了tpe-gal@dox囊泡的成功制备。

2.细胞摄取和细胞内控制释放行为考察

选取hepg2和l02细胞为模型细胞，采用共聚焦激光扫描显微镜(clsm)检测细胞对tpe-gal@dox囊泡的吞噬及细胞内dox的释放情况。

hepg2细胞成像前分别与tpe-gal@dox共同孵育0.5、1、2小时。在使用tpe和dox荧光通道的clsm图像中，如图5所示，荧光强度随着时间的增加而稳定增加，说明hepg2细胞对囊泡的吞噬以及药物从tpe-gal@dox囊泡中释放是成功的，且具有时间依赖性。tpe-gal@dox囊泡共同孵育0.5h后，hepg2细胞开始出明显的tpe和dox荧光，每个细胞都表现出相同的荧光区域。tpe-gal@dox囊泡释放的dox导致tpe和dox荧光重叠，该同时聚集了tpe和dox的区域我们认为与溶酶体相对应。孵育2h后，tpe的荧光在细胞质或溶酶体中清晰可见，未转移至细胞核，说明囊泡只是发挥其传递功能，并不影响药物的抗癌作用。在dox荧光通道中，dox从囊泡中释放，转运到细胞核中，除少量聚集在溶酶体外，大部分位于细胞核内。然而，与hepg2细胞相比，l02细胞虽然有明显的tpe荧光，但是只有微弱的dox荧光。这些现象说明tpe-gal囊泡可以被细胞有效地摄取成像，但只有在肿瘤细胞中才表现出持续的药物释放模式。

体外评价显示，这种自指示的tpe-gal囊泡可以有效地负载抗癌药物阿霉素(dox)。细胞水平上，tpe-gal@dox囊泡比游离dox具有显著的靶效应。提示tpe-gal@dox具有较强的靶向抗肿瘤治疗作用，有望进一步推进可视化药物转运载体在肿瘤治疗领域中的发展。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。