NCS-likePR10基因及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及海南粗榧中苯乙基异喹啉类生物碱合成途径中ncs-likepr10基因及其编码的蛋白与应用。

背景技术：

苯乙基异喹啉类生物碱是众多生物碱种类中的一类，是多种药物的前体，主要包括三尖杉碱、秋水仙碱和高刺酮碱以及它们的衍生物。三尖杉碱和秋水仙碱的衍生物已经广泛用于临床医药，其中三尖杉酯类生物碱是以三尖杉碱为母核的一类特殊生物碱，对治疗急(慢)性粒细胞白血病、单核细胞白血病、早幼粒细胞白血病等非淋巴型白血病有显著疗效(jinetal.,2013)。在这类生物碱中，三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱和脱氧三尖杉酯碱已被证实具有明确的抗癌活性，并且高三尖杉酯碱和三尖杉酯碱在我国现已投入临床使用且疗效显著(中国医学科学院,1979)。另外，美国fda也于2012年批准高三尖杉酯碱进入临床使用，用于治疗慢性粒细胞白血病(cml)(kantarjianetal.,2013)。尽管三尖杉酯类生物碱虽然抗癌功效明显，但因其植物来源单一，仅存于三尖杉属植物中且含量较低，导致成品药价格昂贵。我国高三尖杉酯碱注射液单价为15000元/g，而美国则为36000美金/疗程(abdelkafietal.,2012；kantarjianetal.,2013)。

三尖杉属植物生长速度极慢，生态分布狭窄，加之早期的人为破坏，分布区面积在不断缩小，现今仅呈零星分布，已被列为国家二级重点保护濒危植物，通过砍伐植物获得药品原料来源已被明令禁止。人工化学合成可以生产三尖杉酯类碱，但其合成过程极其复杂，合成难度大且纯度低，生产成本极高，目前仅停留于研究初期，没有实现商业化生产。因此，通过基因工程或细胞工程解决生产三尖杉酯类生物碱的原料来源已成为当前研究的重点，对降低三尖杉酯类生物碱的临床应用成本、提高应用价值具有重要意义。

三尖杉酯类生物碱作为仅存在于三尖杉属植物中的一类生物碱，其生物合成途径已经通过同位素示踪技术进行了推定，即由1分子酪氨酸经过脱羧反应生成多巴胺，而1分子苯丙氨酸经过脱氨基生成3-(4-羟苯基)丙醛，多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛结合生成苯乙基异喹啉中间体，而后经过复杂的扩环反应形成三尖杉碱母核，最后经过与粗榧酸、异粗榧酸等酯化反应生成不同的三尖杉酯类生物碱。但是，当前关于三尖杉酯类生物碱合成途径中的功能基因的研究仍处于初始阶段，相关报道甚少，尤其是其生物合成途径中催化多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛缩合的功能基因更是未见任何报道，该基因及其编码的蛋白序列尚不清楚。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种海南粗榧中催化多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛缩合的ncs-likepr10基因及其编码蛋白。

本发明的目的还在于提供含有上述海南粗榧中催化多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛缩合的ncs-likepr10基因的表达盒、载体、工程菌以及转基因细胞系。

本发明的最后一个目的在于提供上述ncs-likepr10基因、所述ncs-likepr10基因编码蛋白、含有所述ncs-likepr10基因的表达盒、载体、工程菌以及转基因细胞系等在调控多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛反应合成苯乙基异喹啉类生物碱中的应用。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种海南粗榧中催化多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛缩合的ncs-likepr10基因，所述ncs-likepr10基因的cds区核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明通过海南粗榧全长转录组测序结果进行分析，设计一对特异引物(pf正向引物:5’-atggtggcgaaaagtataacag和pr反向引物:5’-ttaacaatatacggtagggttagaga)，对海南粗榧叶片样品cdna进行pcr扩增，获得了催化海南粗榧中催化多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛缩合的功能基因的cds序列(全长483bp)，ncs-likepr10基因的cds序列具体如seqidno:1所示的核苷酸序列。

本发明还提供上述海南粗榧中催化多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛缩合的ncs-likepr10基因的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：本发明还提供了含有上述海南粗榧中催化多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛缩合的ncs-like基因的表达盒、载体、工程菌及转基因细胞系。

作为本发明的一种优选的实施方式，本发明提供的工程菌，将基因ncs-likepr10构建到载体ppic9k上，用所得重组载体转化毕赤酵母菌株gs115，筛选阳性菌株构建酵母工程菌。

作为本发明的一种优选的实施方式，本发明提供的工程菌转基因细胞系，将基因ncs-likepr10构建到载体pktwgf2.0上，用所得重组载体转化烟草by2细胞，筛选阳性转基因细胞株系。

本发明的最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述ncs-likepr10基因、所述ncs-likepr10基因编码蛋白、含有所述ncs-likepr10基因的表达盒、载体、工程菌以及转基因细胞系等在调控多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛反应合成苯乙基异喹啉类生物碱中的应用。

尤其是在促进多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛反应合成苯乙基异喹啉类生物碱方面的应用。及其在基因工程、细胞工程等生物合成技术中的应用。

进一步的，还可以利用将基因工程技术获得的改良植物(该改良植物中苯乙基异喹啉类生物碱含量增加)在食品、保健品和生物医药领域中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明针对海南粗榧中功能基因研究基础薄弱的现状，首次从海南粗榧中克隆得到催化多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛缩合ncs-likepr10基因，该基因为植物苯乙基异喹啉类生物碱合成路径中的关键基因之一，采用基因工程的方法，将ncs-likepr10基因转化到目标植株或悬浮细胞中，可促进苯乙基异喹啉类生物碱含量的增加(通过催化多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛缩合反应合成苯乙基异喹啉类生物碱)，为今后利用基因工程或细胞工程技术获得具有抗癌活性的药物或食物提供了重要的理论依据，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。

附图说明

图1是实施例2中ncs-likepr10蛋白催化多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛进行缩合反应合成苯乙基异喹啉类生物碱的示意图；

图2是实施例2-3中lc-ms检测ncs-likepr10蛋白酶催化产物的质谱图，其中(a)阴性对照样品质谱检测图；(b)ncs-likepr10蛋白催化样品质谱检测图；

图3是实施例4中通过激光共聚焦显微镜观察到的ncs-likepr10转入by2烟草细胞后的gfp绿色荧光信号及亚细胞定位，转化成功的by2烟草细胞能明显表达gfp绿色荧光。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1ncs-likepr10基因克隆

根据前期海南粗榧全长转录组测序结果进行分析，设计一对特异引物(pf正向引物:5’-atggtggcgaaaagtataacag和pr反向引物:5’-ttaacaatatacggtagggttagaga)，采用天根rnapreppurekit总rna提取试剂盒从海南粗榧叶片中提取叶片总rna，并反转录合成cdna，利用上述引物pf和pr从反转录得到的cdna中扩增出如seqidno:1所示的海南粗榧中催化多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛缩合的ncs-likepr10基因的cds序列，ncs-likepr10基因的cds序列全长483bp。

具体步骤如下：

(1)将新鲜海南粗榧叶片用液氮冷却研磨，精确称取100mg粉末加入液氮预冷的2ml离心管中，并加入天根rnapreppurekit总rna试剂盒裂解液，涡旋混匀后静置10min；

(2)根据天根rnapreppurekit总rna试剂盒操作说明书步骤提取海南粗榧叶片总rna；

(3)从海南粗榧叶片中提取的总rna为模板，利用反转录酶试剂盒primescript^tmrtmastermix(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cdna第一条链，反应条件按照试剂盒说明书进行；

(4)利用上述引物pf和pr从rna反转录得到的cdna中扩增出海南粗榧中催化多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛缩合基因ncs-like的cds序列；

(5)反应条件：94℃预变性4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，33个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的pcr产物采用in-fusion克隆(购自clontech公司)连入表达载体pet21b、ppic9k和pktwgf2.0，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。从阳性克隆中提取携带有基因ncs-like序列的质粒，命名为ppic9k-ncs-likepr10质粒和pktwgf-ncs-likepr10质粒。

实施例2ncs-likepr10蛋白功能验证

为分析基因ncs-likepr10编码蛋白的催化功能，本实施例对ncs-likepr10蛋白进行了大肠杆菌异源表达并得到纯化蛋白，通过体外饲喂该基因催化反应的前体化合物多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛、lc-ms检测产物的合成来验证其基因功能。

具体步骤如下：

(1)将实施例1中得到的pet21b质粒按照转入bl21(de3)大肠杆菌并诱导表达；诱导条件为：iptg浓度100μm，诱导温度20℃，诱导时间24h。

(2)将诱导得到的可溶性蛋白通过镍柱纯化，详细步骤参照说明书。

(3)纯化蛋白体外功能验证试验步骤如下：反应体积50μl，50μm多巴胺溶液1μl，500μm3-(4-羟苯基)丙醛母液1μl，ncs-likepr10纯化蛋白10μg，tris-hclbuffer(ph7.8)补足50μl；阴性对照为50μm多巴胺溶液1μl，500μm3-(4-羟苯基)丙醛母液1μl，tris-hclbuffer(ph7.8)48μl。

(4)ncs-likepr10蛋白催化反应详见图1，该催化产物为苯乙基异喹啉类生物碱中间体，分子量约为285。

(5)蛋白功能验证结果通过lc-ms检测获得，结果详见图2，其中a图为阴性对照样品质谱图，未能检测到分子量为286.1437的催化产物；b图为ncs-likepr10蛋白催化样品质谱图，可以检测到分子量为286.1437的催化产物。

lc-ms详细参数如下：

液相色谱参数：选用agilent1290ⅱ型超高压液相色谱仪，agilentinfinitylabec-c18色谱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)，流动相乙腈-0.2％甲酸水溶液，梯度洗脱，洗脱流速0.3ml/min，进样量2μl，柱温30℃；

质谱参数：离子源为电喷雾离子化源(esi),使用4000kv的esi电压产生并聚焦离子，鞘气(氮气)流量为40arb，辅助/吹扫气体(氮气)流量为15arb，毛细管温度350℃，采用阳离子模式采集信号。

实施例3ncs-likepr10基因酵母重组表达验证

为了更好地分析基因ncs-likepr10编码蛋白的催化功能，进一步将该基因在酿酒酵母(gs115)中实现重组表达，通过饲喂该基因催化反应的前体化合物多巴胺和3-(4-羟苯基)丙醛、lc-ms检测产物的合成来验证其基因功能。具体步骤如下：

(1)将实施例1中得到的ppic9k-ncs-like质粒按照yeastmaker^tm(购自clontech公司)操作步骤转化酵母菌株gs115；以空白载体为阴性对照，转入酵母菌株gs115。

(2)将转化后的gs115酵母菌株，30℃培养2-3天，长出单克隆。

(3)挑单克隆到5mlsddropout液体培养基里摇24个小时，30℃，200rmp。(2ml用来做下一步试验，3ml用来保菌)

(4)取2ml单克隆菌液5000rmp离心1min,弃上清，沉淀转移20mlsddropout培养基中，加入100μl甲醇,30℃，200rmp培养24h。

(5)测od600，按照比例用sddropout培养基将菌液a600值稀释至0.8，总体积为10ml，加入50μl甲醇过夜培养。

(6)培养液5000rmp离心5min，弃上清，沉淀用2mlsddropout培养基重悬并加入20μl多巴胺盐酸盐溶液(母液浓度为50mm)和20μl3-(4-羟苯基)丙醛溶液(母液浓度为50mm)，30℃，200rmp培养24h。

(7)培养液用15000r/min离心1min，将上清液转移至5ml离心管中，剩下菌体再提取。菌体中加入500μl甲醇，超声提取15min，再用5000r/min离心5min，吸取上清于上一步的5ml离心管中。将提取液经0.22μm滤膜滤过，lc-ms检测。

lc-ms检测方法如实施例2所述，检测结果类似图2中b图。

实施例4ncs-likepr10基因表达载体的构建与转化烟草by2悬浮细胞

为了更好地分析基因ncs-likepr10编码蛋白的功能和亚细胞定位，进一步将该基因构建到带gfp荧光标记的载体中然后转入烟草by2悬浮细胞中实现重组表达，通过激光共聚焦显微镜来观察其亚细胞定位。具体步骤如下：

(1)将实施例1中得到的pktwgf-ncs-likepr10质粒通过热激转化方法转化农杆菌；该载体带有gfp绿色荧光标签，可以通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光来验证转化结果。

(2)挑选农杆菌单克隆接种到5mllb培养基中28℃过夜培养。

(3)从过夜培养的农杆菌中吸取1.5ml转接到50ml新鲜lb培养基中28℃振荡培养3-5h至od600＝0.8-1.0。

(4)收集农杆菌菌液并离心，弃上清，菌体用180μl共转培养基重悬。

(5)选择培养3-4天的烟草by2悬浮细胞，用700-1000ml共转培养基清洗过滤后，吸取5mlby2悬浮细胞至农杆菌菌体中，振荡培养15min。

(6)转移振荡培养后的by2悬浮细胞至共转培养基平板上，共培养3-4天。

(7)转移共培养后的by2悬浮细胞至筛选培养基平板上筛选阳性细胞并转入液体筛选培养基悬浮培养。

(8)通过激光共聚焦显微镜观察，成功转入ncs-likepr10蛋白的by2烟草细胞能明显表达gfp绿色荧光且该蛋白定位于细胞核和微丝骨架，详见图3。

虽然已经结合优选实施例对本发明进行了描述，但应当理解本发明的保护范围并不局限于这里所描述的实施例。结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。

序列表

<110>中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

海南大学

<120>ncs-likepr10基因及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>483

<212>dna

<213>海南粗榧中催化多巴胺和3-(4-羟苯基丙醛缩合基因ncs-likepr10)

<400>1

atggtggcgaaaagtataacagtagaaattgattctccagtggaggcaaagagattttgg60

gctgcaattgttaaggactatgatctcctccctaggcaaatgccaggggtatgttcaggc120

gtcacacttgttaaaggcgacggaggtgtcggcaccatcatacaaattgactacacccct180

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gccgctggtctcttaaaatccatagaagcatacctcgtctctaaccctaccgtatattgt480

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<210>2

<211>160

<212>prt

<213>海南粗榧中催化多巴胺和3-(4-羟苯基丙醛缩合基因ncs-likepr10)

<400>2

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151015

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145150155160