一种后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物及设计和扩增方法与流程

文档序号：19830212发布日期：2020-02-04 12:20阅读：1057来源：国知局

本发明属于动物分子生物学领域，涉及一种后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物及设计和扩增方法。

背景技术：

后睾科、异形科、nanophyetidae和棘口科的吸虫是最重要的人畜共患寄生虫。在后睾科中，华支睾吸虫是最为重要的寄生虫。据报道，在我国华支睾吸虫的感染人口高达1290万人。除了能够感染人外，还可以寄生在犬、猫、猪等终末宿主。因此，华支睾吸虫病是一种非常重要的人畜共患寄生虫病。东方次睾吸虫与华支睾吸虫的生活史相似，虽然东方次睾吸虫主要感染禽类，但是人也有感染的报道。目前报道显示：在黑龙江流域的鱼类中，最主要的两种吸虫囊蚴是华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴。而且这两种吸虫的囊蚴相似，这可能导致东方次睾吸虫病误诊为华支睾吸虫病。但是迄今关于东方次睾吸虫核糖体序列的报道极少，其中关于其核糖体内转录间隔区的研究更是空白。

近年来，由于pcr直接测序方法的建立以及广泛使用，研究学者越来越关注its的使用。its的进化速率相对其他各部分基因快，往往被用于低阶元间的进化分析，以及种属内、不同个体间的差异。对核糖体its的研究结果显示：its1、its2序列对于鉴定寄生虫的虫种是很有价值的遗传标记基因。通过对its序列进行分析发现，its1、its2序列变异位点相对较多，这些变异位点通常包含较多的信息。因此，如果能对寄生虫的its区段进行扩增，然后进行序列分析，对于寄生虫的种属鉴定将具有重要的意义。但是，现有技术中对于一次扩增，可以获取多个its区段的通用引物，研究尚少。

技术实现要素：

本发明的第一目的是提供一种后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物，通过扩增可以获取多个its区段，方便对于its区段的变异点进行测序分析。

本发明的第二目的是提供上述后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物的设计和扩增方法。

本发明的第三目的是提供上述后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物的应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物，所述正向引物序列为：acaatgacggtttcagcgagt(seqidno.1)，反向引物序列为：cacaaacaacccgactccaagg(seqidno.2)。

二、一种根据上述的后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物的设计和扩增方法，该方法包括以下步骤：

(1)从genbank获取后睾科吸虫28srdna和18srdna序列，利用clusta1xvl.83做序列的比对，分别在3’端和5’端找出保守序列，作为引物候选区；

(2)利用oligov6软件对候选区序列进行分析，设定引物序列选择条件。

进一步的，所述步骤(2)中引物序列选择条件为：引物长度21-24bp左右，gc含量40％-65％，退火温度为50-55℃。

三、上述的后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物在鉴别一种后睾科吸虫中的应用。

进一步的，所述的鉴定过程为：提取待鉴别后睾科吸虫的基因组dna，使用通用引物对提取的dna进行核糖体内转录间隔区扩增反应，对扩增产物进行纯化测序。

进一步的，所述扩增反应体系为：取100ng模板dna，0.5ul浓度为10umol/l的上游引物，0.5ul浓度为10umol//l的下游引物，2.5ul10xextaqbuffer，2ul浓度为10mmol/l的dntp，0.2ulextaq聚合酶混合，加双蒸水至25ul。

进一步的，所述扩增反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，进行35个循环，最后72℃延伸7min。

采用上述技术方案的积极效果：本发明所公开的引物设计方法是基于核糖体内转录间隔区(its)两端保守的18srdna和28srdna序列设计，所得到的引物扩增效率高，扩增的its、1its2进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异；将该引物用于华支睾吸虫和东方次睾吸虫的鉴别，准确度高，克服了形态特征鉴定的缺陷，解决了种质混杂的问题，所得的引物应用范围广，对核糖体内转录间隔区的研究具有重要的意义。

附图说明

图1为扩增产物的电泳条带，图中，m为dnamarker，泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10为扩增产物的电泳结果；

图2为华支睾吸虫和东方次睾吸虫的its1同源性分析结果图；

图3为华支睾吸虫和东方次睾吸虫的its2同源性分析结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

后睾科一种吸虫核糖体内转录间隔区(its)通用引物设计方法，包括如下步骤：

1)从genbank获得后睾科吸虫18srdna和28srdna序列，利用clusta1xvl.8做序列比对，分别在5’和3’端寻找保守的区域，左右引物的候选区；

2)利用oligov6软件对候选区的序列进行分析，引物序列的选择条件为：引物长度21-34bp，gc含量在40％-65％，退火温度为50-55℃。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例2

后睾科两种吸虫核糖体内转录间隔区(its)序列的测定及分析，方法如下：

(1)基因组dna的提取：用基因组dna试剂盒提取华支睾吸虫和东方次睾吸虫的基因组dna，然后溶于te，-20℃保存；

(2)its的扩增：反应条件如下：取100ng模板dna，0.5ul浓度为10umol/l的上游引物，0.5ul浓度为10umol//l的下游引物，2.5ul10xextaqbuffer，2ul浓度为10mmol/l的dntp，0.2ulextaq聚合酶混合，加双蒸水至25ul。扩增反应在pcr仪上进行：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸1min50s，进行35个循环，最后72℃延伸7min。

(3)测序及划界：将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果如图1所示。条带1-5为华支睾吸虫，条带6-10为东方此睾吸虫。然后对这些条带进行胶回收并测序，然后通过序列分析去掉两端引物侧的18s和28s的序列，并对its1和its2进行划界，最终结果如下：

华支睾吸虫1的its1测序结果如seqidno.3所示，华支睾吸虫2的its1测序结果如seqidno.4所示，华支睾吸虫3的its1测序结果如seqidno.5所示，华支睾吸虫4的its1测序结果如seqidno.6所示，华支睾吸虫5的its1测序结果如seqidno.7所示；

华支睾吸虫1的its2测序结果如seqidno.8所示，华支睾吸虫2的its2测序结果如seqidno.9所示，华支睾吸虫3的its2测序结果如seqidno.10所示，华支睾吸虫4的its2测序结果如seqidno.11所示，华支睾吸虫5的its2测序结果如seqidno.12所示；

东方次睾吸虫1的its1测序结果如seqidno.13所示，东方次睾吸虫2的its1测序结果如seqidno.14所示，东方次睾吸虫3的its1测序结果如seqidno.15所示，东方次睾吸虫4的its1测序结果如seqidno.16所示，东方次睾吸虫5的its1测序结果如seqidno.17所示；

东方次睾吸虫1的its2测序结果如seqidno.18所示，东方次睾吸虫2的its2测序结果如seqidno.19所示，东方次睾吸虫3的its2测序结果如seqidno.20所示，东方次睾吸虫4的its2测序结果如seqidno.21所示，东方次睾吸虫5的its2测序结果如seqidno.22所示。

(4)同源性分析：将划界好的its1和its2序列分别用megalign进行同源性分析。its1和it2s的结果分别如图2和图3。同源性分析表明，华支睾吸虫和东方次睾吸虫的its1的种内差异分别是0％-0.3％和0％-0.6％，华支睾吸虫和东方次睾吸虫的its2的种内差异是0；华支睾吸虫和东方次睾吸虫的its1和its2的种间差异分别是8.8％-9.6％和7.7％。

本发明所公开的引物设计方法是基于核糖体内转录间隔区(its)两端保守的18srdna和28srdna序列设计，所得到的引物扩增效率高，扩增的its、1its2进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异；将该引物用于华支睾吸虫和东方次睾吸虫的鉴别，准确度高，克服了形态特征鉴定的缺陷，解决了种质混杂的问题，所得的引物应用范围广，对核糖体内转录间隔区的研究具有重要的意义。

序列表

<110>黑龙江八一农垦大学

<120>一种后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物及设计和扩增方法

<130>b014

<141>2019-10-31

<160>22

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acaatgacggtttcagcgagt21

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cacaaacaacccgactccaagg22

<210>3

<211>656

<212>dna

<213>华支睾吸虫(clonorchissinensis)

<400>3

acagtacacaaagcccaaacacctcagttaatctgagcatttggcacgggtcgtcatgcc60

cgttgttcttgcagccttgcctgcctagggcggagcgattctagttccgtcatctgtctt120

gcagcattgtctgcctagggcggagcgatcctagttccgtcatgttctacatgtatgttc180

cgcatgcatgctgcagcgttgtctgcctacggtggagcgtctctagttctaccaattcct240

ggctatacctggcacgtgtacccaatatatatgatgtgcctacgtacagtcgcgtttcgg300

cagggtgcctacccgtctgatgctctcggtatgctcgcttccgttggtggccagtccata360

ttgggggtgacgggatgtgctgtcagaatggacagtgctaggcttaatgagtgggcatga420

tgtgtctcgagctacggctcacccaccgccctgatgttgttgttcatttcaaaccgtttt480

acactgttaaagtgtttcaggttggcgtggcctgactggctggccggcttgtctcactgc540

cccgacatgcacccggtgttctacactggactgcatgtgcagtcgcccggcggtgcctta600

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<210>4

<211>656

<212>dna

<213>华支睾吸虫(clonorchissinensis)

<400>4