一种梯级物理场制备高抗癌抗氧化活性诺丽多糖的方法与流程

本发明涉及诺丽多糖，具体涉及一种梯级物理场制备高抗癌抗氧化活性诺丽多糖的方法。

背景技术：

诺丽果学名海天戟天(morindacitrifolial.)，原产于东南亚，大洋洲和澳大利亚，这种植物主要生长在亚热带和热带地区，在我国主要种植于海南地区。诺丽果被誉为“上帝的礼物”，其果实拥有丰富的多糖、矿物质、维生素、多酚黄酮类等物质，在波利尼西亚等地区作为传统医用药物已经有两千多年的历史。近年来，诺丽果被证实有抗氧化、抗炎症、抗癌症等保健功效，而这些功效与其多糖成分显著相关。

多糖的抗氧化和抗癌活性与分子量大小和糖醛酸含量显著相关，一般来说分子量越小，糖醛酸含量越高的多糖其抗癌和抗氧化活性越高。除此之外多糖还能与金属元素螯合形成多糖-金属元素螯合物增强其抗癌作用。例如，公开号为cn104277134a发明专利中公开的竹荪多糖-锌螯合物和公开号为cn104031156a发明专利中公开的夏枯草多糖-锌螯合物相较于原料多糖都具有更强的抗癌作用。其中，多糖与金属元素的螯合能力对其抗癌能力有显著影响。所以能得到更小分子量，更高糖醛酸含量和更强的金属元素螯合能力多糖对于其在抗癌方面的应用上有重要意义。

现有关于低分子量多糖的制备方法主要有高温水解法，酸性水解法和酶解法。采用高温水解法制备低分子量多糖，能耗高耗时长且得率低。采用酸性水解法时会产生酸性废液，对环境有一定的污染。采用酶解法成本昂贵，反应条件要求高，无法大规模生产。所以，市场急需一种能高效、绿色安全制备低分子量多糖的方法。此外，目前也没有关于梯级物理场制备低分子量多糖的相关研究被报道。

目前关于诺丽多糖的提取主要还是采用传统水热提取法，该方法能耗高、时间长且诺丽多糖得率低、纯度低、活性差。所以本领域急需一种高效且能最大限度保护诺丽多糖活性的提取技术。

技术实现要素：

为了克服现有技术上的不足及缺陷，本发明的目的在于提供一种利用多物理场协同制备诺丽多糖的方法，实现了低能耗，高效率、高得率且所制备产品分子量小，抗癌活性强，为诺丽多糖的提取及应用提供了指导。

该技术发明原理：本发明先用间断式脉冲电场处理原料随后马上转入超声场中进行处理，待超声处理后提取液转入连续式脉冲电场中进行处理。诺丽果粉在高压脉冲电场低频放电下，细胞壁和细胞膜被击穿形成孔洞裂缝，更利于超声波的空化作用在细胞内和细胞表面发挥，实现了多糖的高效提取。提取后的大分子多糖在连续高频脉冲电场作用下，分解为小分子多糖。

本发明的目的通过以下步骤实现：

一种梯级物理场制备高抗癌抗氧化活性诺丽多糖的方法，包括如下步骤：

1)诺丽果原料处理：将诺丽果烘干，打粉，过筛，加入乙醇溶液，回流处理脱脂脱色后烘干，得诺丽果粉；

2)梯级物理场制备诺丽多糖：诺丽果粉加入蒸馏水，室温下放入间断式脉冲电场提取设备中处理30-40次，脉冲频率为1-5hz，处理场强为3-6kv/cm；随后转入超声设备进行处理，超声功率为300-600w，频率为20-40khz，温度维持在50-60℃，超声时间为20-30min；随后将提取液转入连续式脉冲电场处理，处理场强10-25kv/cm，频率为500-1300hz，脉宽为60-80us，处理时间为40-50min；

3)诺丽多糖纯化：处理完后，将提取液离心分离，得多糖粗提液，加入sevage试剂，涡旋振荡，去除沉淀，重复离心分离，加入sevage试剂，涡旋振荡，去除沉淀4-6次直至完全去除蛋白质无沉淀析出，醇沉，离心分离，沉淀冻干，得到诺丽多糖。

为进一步实现本发明目的，优选地，步骤1)中，所述的诺丽果烘干是将将诺丽果在45-50℃烘干处理48-60h。

优选地，步骤1)中，所述的过筛为过80-100目筛。

优选地，步骤1)中，所述的乙醇溶液为按体积百分比计75％-85％的乙醇水溶液。

优选地，步骤1)中，所述的回流处理是指70-80℃回流处理4h。

优选地，步骤1)中，所述的诺丽果为白熟阶段的成熟诺丽果实。

优选地，步骤2)中，所述的诺丽果粉加入蒸馏水的料液比为1:25-1:35，所述的料液比的诺丽果粉质量与蒸馏水的单位分别为克和毫升。

优选地，步骤3)中，所述的离心分离的转速为4800-5000rpm，离心分离的时间为15-20min。

优选地，步骤3)中，所述的sevage试剂的配制方法为将氯仿、正丁醇体积比为3.5：1-4.5：1混合，所述的多糖粗提液与sevage试剂的体积比为1：1-1：5，涡旋振荡的时间为10-20min。

优选地，步骤3)中，所述的醇沉是往粗提液中加入3.5-4.5倍体积无水乙醇在1-4℃下醇沉12-20h。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果。

1)本发明利用梯级物理场提取诺丽多糖，该方法相较于传统水提法，能耗低，提取时间短，且多糖得率、糖醛酸含量和总糖含量相较于传统水热法提取的诺丽多糖都显著增加，分别增加98％，20％，150％以上。

2)本发明利用梯级物理场技术能够快速高效制备小分子诺丽多糖，相较于传统水热法提取的诺丽多糖，分子量减小40％以上。并且在提取制备过程中不需要添加酸和酶，不需要长时间加热，是一种绿色节能低成本的制备工艺。

3)本发明利用梯级物理场提取的诺丽多糖相较于传统水热法提取的诺丽多糖抗氧化性能和抗癌能力都显著提升。

4)本发明利用梯级物理场提取出来的诺丽多糖相较于传统水热法提取的诺丽多糖对金属元素锌的螯合能力更强，螯合后形成的诺丽多糖-锌螯合物的抗癌活性也更好，且增幅更大。

附图说明

图1是本发明一种梯级物理场制备高抗癌抗氧化活性诺丽多糖的方法的工艺流程图。

图2实施例1中水提法和梯级物理场法所得诺丽多糖hpgpc检测分子量的结果。

图3实施例2中水提法和梯级物理场法所得诺丽多糖hpgpc检测分子量的结果。

图4实施例3中水提法和梯级物理场法所得诺丽多糖hpgpc检测分子量的结果。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式不限如此。

实施例中，间断式脉冲电场设备为广州市心安食品科技有限公司的pef-ex-500型脉冲电场提取仪。所用连续式脉冲电场设备为广州市心安食品科技有限公司的sy-z-500型脉冲电场灭菌设备。

实施例1

如图1所示，一种梯级物理场制备高抗癌抗氧化活性诺丽多糖的方法，包括如下步骤：

诺丽果原料处理：将诺丽果(诺丽果为白熟阶段的成熟诺丽果实)50℃烘干、打粉、过筛(过80目筛)，按体积加入4倍体积百分比80％乙醇溶液回流处理4h脱脂脱色后烘干即得诺丽果粉。

梯级物理场辅助提取诺丽多糖：取35g诺丽果粉按料液比1:35(料液比的诺丽果粉质量与蒸馏水的单位分别为克和毫升)加入蒸馏水放入间断式脉冲电场提取设备中处理30次，脉冲频率为1hz，处理场强为3kv/cm，随后采用超声设备超声处理20min，超声功率为300w，40khz频率，温度维持在60℃。待超声处理完后转入连续式脉冲电场设备处理40min，场强20kv/cm，脉宽60us，频率500hz。

处理完后，提取液4800rpm离心15min后，离心分离取上清液合并后得多糖粗提液，加入sevage试剂，sevage试剂的配制方法为将氯仿、正丁醇体积比为4：1混合，多糖粗提液与sevage试剂的体积比为1：1，涡旋振荡10min，去除沉淀，重复离心分离取上清液合并后得多糖粗提液，加入sevage试剂，涡旋振荡，去除沉淀，共计6次，sevage试剂的配制方法不变，完全去除多糖粗提液中蛋白质直至无沉淀析出，往粗提液中加入4倍体积无水乙醇，在4℃下醇沉12h，随后离心分离，取沉淀冻干，得到诺丽多糖。

传统水提法提取诺丽多糖：取35g诺丽果粉按料液比1：35加入蒸馏水，80℃水浴提取2小时。处理完后，提取液4800rpm离心15min分离后合并得多糖粗提液，加入sevage试剂，sevage试剂的配制方法为将氯仿、正丁醇体积比为4：1混合，多糖粗提液与sevage试剂的体积比为1：1，涡旋振荡10min，去除沉淀，重复6次直至无沉淀析出，往粗提液中加入4倍体积无水乙醇在4℃下醇沉12h，随后离心分离取沉淀冻干得到诺丽多糖。

多糖提取率(％)＝多糖质量/诺丽果粉末质量×100

总糖浓度采用苯酚-硫酸法测定。采用苯酚-硫酸法测定诺丽果多糖的总糖含量。标准曲线的制作：于1l容量瓶中配置1mg/ml的葡萄糖溶液，分别吸取1、2、3、4、5、6ml的母液于100ml容量瓶中定容。然后分别吸取0.5ml各梯度溶液于10ml离心管中，然后加入0.5ml苯酚溶液(5％)及2.5ml浓硫酸，充分混合，室温下静置10min，30℃下水浴15min，在490nm处用酶标仪测定吸光值，建立标准曲线。准确称取一定量的诺丽果粗多糖，加入去离子水溶解，按上述操作测定吸光值，同时应确保吸光值落在上述标准曲线范围内，通过计算得到诺丽果粗多糖总糖含量。

糖醛酸含量的测定。糖醛酸含量采用离子色谱法测定。检测设备为dionexics-3000离子色谱仪，检测条件为：色谱柱carbopacpa20分析柱，carbopa1保护柱；检测器脉冲安倍检测器；进样量10ul；检测温度30℃；流速0.5ml/min；流动相a为超纯水，b为200mmnaoh溶液，c为500mm醋酸钠溶液，d为20mmnaoh溶液。分别称取糖醛酸标准品1.0g，定容至1000ml，稀释配置成1.0，2.0，5.0，8.0，10.0ug/ml提取浓度标准样，按上述条件进样检测，以峰面积为横坐标，糖醛酸含量为横坐标绘制标准曲线。10mg样品在5ml4m三氟乙酸中105℃水解6h，随后取1ml样品去离子水稀释至100ml。取稀释后样品1ml过0.22um水相膜后进行测定后，将峰面积带入标准曲线计算糖醛酸含量。

多糖分子量大小采用高效凝胶色谱(hpgpc)法测定。用流动相(kh2po4，0.02m)将多糖配置成1mg/ml的溶液后进样检测。检测条件为：柱温35℃，流速0.6ml/min，进样量20ul,检测器waters2414示差检测器，色谱柱tsk-gel5000k凝胶柱(7.8mm×300mmpwxl)和tsk-gel3000k凝胶柱(7.8mm×300mmpwxl)，0.02mol/lkh2po4(ph6.0)溶液作为流动相。

诺丽多糖的抗氧化活性采用dpph法，abts法，去羟基自由基法三种方法检测。

dpph法：用去离子水将诺丽多糖配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/ml的溶液，准确移取100ul多糖溶液和100uldpph(200um，无水乙醇配制)于酶标板中，混匀，室温静置30min后，采用酶标板在517nm处测定吸光值，以抗坏血酸为阳性对照。dpph清除率按照下列公式进行计算：

dpph自由基清除率(％)＝[1-(as-ab)/ac]×100

其中as样品组的吸光值，ab为样品与无水乙醇的吸光值，ac为去离子水代替样品与dpph的吸光值。

abts法：用去离子水将诺丽果多糖配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/ml的溶液以备用。等体积混合abts(7.00mm)溶液与过硫酸钾溶液(2.45mm)，室温避光反应16h后，将混合液稀释至其734nm处在的吸光值为0.7(±0.03)。将20μl的多糖溶液与150μl的abts溶液充分混匀后，室温避光反应30min，用酶标仪测定其在734nm处的吸光值。以抗坏血酸为阳性对照。abts清除率按照下列公式进行计算：

abts自由基清除率(％)＝[1-(as/a)]×100

其中as为样品组的吸光值，a为去离子水代替样品的吸光值。

去羟基自由基法：用去离子水将诺丽果多糖配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/ml的溶液以备用。向酶标板中加入50ul硫酸亚铁溶液(1.5mm)，再加入35ul双氧水(6.7mm)和15ul水杨酸钠溶液(20mm)，接着添加100ul样品溶液，充分混匀，在37℃下反应1h后，于562nm处测定吸光值。以抗坏血酸为阳性对照。去羟基自由基清除率按照下列公式计算：

去羟基自由基清除率(％)＝[1-(as-ab)/ac]×100

其中as为样品组的吸光值，ab为去离子水代替水杨酸钠的吸光值，ac为去离子水代替样品的吸光值。

诺丽多糖与zn元素螯合。室温下，调节氯化锌溶液(2mg/ml)，ph至氯化锌完全溶解，随后分别加入5mg/ml本实施例梯级物理场辅助提取以及传统水提法提取的诺丽多糖溶液10ml混匀，用氢氧化钠调节ph至弱碱性(ph7-8)。分别将两种混合液放置于50℃培养箱之中的摇床上，恒温恒湿反应2天。反应完成后，将反应液倒入离心管，8000转离心5min，将上清液倒入2.5kda透析袋中，置于4℃冰箱中，用超纯水透析3次。透析完成后，将混合液真空冷冻干燥，两种干燥的诺丽多糖-zn螯合物样品放置于干燥器中保存备用。

螯合物锌元素含量采用aas元素分析仪测定。称取适量样品于锥形瓶中，加入混合酸(硝酸：高氯酸＝4：1)后消化过夜，随后在电热板上进行消解，待消解完成后再加入混合酸直至消化液呈无色透明。将消化液转移至25ml容量瓶中用蒸馏水定容，使用z-5000元素分析仪(aas)，采用锌标准溶液绘制标准曲线，测得样品中锌元素含量。

诺丽多糖及诺丽多糖锌螯合物抗癌效果测定采用cck-8法，以人肝癌hepg2细胞为实验对象。在96孔板中配置100μl的细胞悬液，每孔4×10³个密度进行接种。将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5％co2的条件下)。向培养板加入10μl不同浓度的待测物质。在培养箱孵育48小时后向每孔加入10μlcck-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响od值的读数)。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加cck-8之前更换新鲜培养基(除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)，去掉待测物质影响。将培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。细胞存活率按照以下公式计算。

细胞存活率(％)＝[(as-ab)/(ac-ab)]×100

as为实验孔吸光度(含有细胞，培养基，cck-8和待测化合物的孔的吸光度)。ab为空白孔吸光度(含有培养基和cck-8的孔的吸光度)。ac为对照孔吸光度(含有细胞，培养基和cck-8的孔的吸光度)。

经测定多糖提取率，总糖含量和糖醛酸含量如表1所示。由表1可知，梯级物理场诺丽多糖提取率为13.42％，相较于传统水提法提取率(6.57％)增加104％。其次，梯级物理场所提诺丽多糖中总糖含量高达90.14％，相较于传统水提法总糖含量(74.14％)增加27％，此外，梯级物理场所提诺丽多糖中糖醛酸含量为3.21％，相较于传统水提法糖醛酸含量(1.24％)增加158％。由结果可知，用梯级物理场提取诺丽多糖提取率远高于传统水提法，并且所提多糖总糖含量和糖醛酸含量都明显高于传统水提法所提多糖。

经测定诺丽多糖分子量大小结果如图2所示，由高效凝胶色谱结果可知，梯级物理场法所提诺丽多糖分子量大小为34kda，水热法所提诺丽多糖分子量为62kda。相较于水热法所提诺丽多糖，梯级物理场所提诺丽多糖分子量降低45％。

表1.不同提取方法对诺丽多糖提取率，总糖含量和糖醛酸含量的影响

不同字母代表存在显著差异(p<0.05)

水热法和梯级物理场法所提诺丽多糖抗氧化活性评价结果如表2所示。由表2可知，梯级物理场所提诺丽多糖在1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/ml浓度下dpph，abts，去羟基自由基清除率都要高于水热法所提诺丽多糖。说明在相同浓度下梯级物理场所提诺丽多糖比水热法所提诺丽多糖表现出更强的抗氧化活性。

表2.水热法和梯级物理场法所提诺丽多糖抗氧化评价结果

诺丽多糖与锌元素螯合后，由ass元素分析仪测得两种诺丽多糖-锌螯合物中锌的含量，结果如图4所示。梯级物理场法所提诺丽多糖形成的螯合物中锌含量为6.44％，而水热法所提诺丽多糖形成的螯合物中锌含量仅为2.53％。相较于水热法所提诺丽多糖形成的螯合物，梯级物理场所提诺丽多糖对锌元素有更强的结合能力

多糖和多糖-锌螯合物抗癌效果结果如表3所示。

两种方法所提诺丽多糖对人肝癌hepg2细胞都显示出一定的抑制效果，并且表现出剂量依赖性。其中，在所选浓度梯度下，添加了梯级物理场所提诺丽多糖的hepg2细胞存活率都比添加了水热法所提诺丽多糖低。具体表现为，在125，250，500ug/ml浓度下，添加梯级物理场所提诺丽多糖的hepg2细胞存活率分别为61.2％，42.3％，24.5％，而添加了水热法所提诺丽多糖的hepg2细胞存活率分别为81.3％，58.2％，42.4％。由实验结果知，梯级物理场所提诺丽多糖表现出更强的抗癌活性。

两种诺丽多糖与锌元素螯合后其抗癌效果有显著提升，并表现出剂量依赖性。在125，250，500ug/ml三个浓度下，水热法所提诺丽多糖螯合锌后，使人肝癌hepg2细胞存活率降低了17.98％，13.99％，2.28％。而梯级物理场所提诺丽多糖螯合锌后，使人肝癌hepg2细胞存活率降低了21.32％，20.16％，4.79％。由结果知，螯合锌后对梯级物理场所提诺丽多糖的抗癌活性增幅要大于水热法所提诺丽多糖，其原因主要是由于梯级物理场所提诺丽多糖对锌元素螯合能力更强，能够结合更多锌元素使其抗癌活性增强。

表3.两种诺丽多糖及其锌螯合物对人肝癌hepg2细胞存活率影响结果

实施例2

如图1所示，一种梯级物理场制备高抗癌抗氧化活性诺丽多糖的方法，包括如下步骤：

诺丽果原料处理：将诺丽果(诺丽果为白熟阶段的成熟诺丽果实)48℃烘干打粉过筛(过80目筛)，按体积加入4倍体积百分比85％的乙醇溶液回流处理4h脱脂脱色后烘干即得诺丽果粉。

梯级物理场辅助提取诺丽多糖：取30g诺丽果粉按料液比1：30加入蒸馏水放入间断式脉冲电场提取设备中处理35次，脉冲频率为5hz，处理场强为5kv/cm，随后采用超声设备超声处理28min，超声功率为600w，超声频率为40khz，温度维持在55℃。待超声处理完后转入连续式脉冲电场设备处理48min，场强20kv/cm，脉宽70us，频率1000hz。

处理完后，提取液4900rpm离心18min后取上清液合并得多糖粗提液，加入sevage试剂，sevage试剂的配制方法为将氯仿、正丁醇体积比为3.5：1混合，多糖粗提液与sevage试剂的体积比为1：4，涡旋振荡15min，去除沉淀，重复4次直至完全去除蛋白质无沉淀析出，往粗提液中加入3.5倍体积无水乙醇，在2℃下醇沉18h，随后离心分离，取沉淀冻干，得到诺丽多糖。

传统水提法提取诺丽多糖：取30g诺丽果粉按料液比1：30加入蒸馏水，60℃水浴提取2小时。处理完后，提取液4900rpm离心18min后取上清液合并得多糖粗提液，加入sevage试剂，sevage试剂的配制方法为将氯仿、正丁醇体积比为3.5：1混合，多糖粗提液与sevage试剂的体积比为1：4，涡旋振荡15min，去除沉淀，重复4次直至完全去除蛋白质无沉淀析出，往粗提液中加入3.5倍体积无水乙醇，在2℃下醇沉18h，随后离心分离，取沉淀冻干，得到诺丽多糖。

所得诺丽多糖的得率、总糖含量、糖醛酸含量、分子量大小、抗氧化活性、与锌元素结合能力、抗癌活性能指标按照实例1的方法进行检测。

经测定多糖提取率，总糖含量和糖醛酸含量如表4所示。由表4可知，梯级物理场诺丽多糖提取率为12.45％，相较于传统水提法提取率(6.12％)增加103％。其次，梯级物理场所提诺丽多糖中总糖含量高达88.43％，相较于传统水提法总糖含量(72.19％)增加22％，此外，梯级物理场所提诺丽多糖中糖醛酸含量为3.18％，相较于传统水提法糖醛酸含量(1.20％)增加165％。由结果可知，用梯级物理场提取诺丽多糖提取率远高于传统水提法，并且所提多糖总糖含量和糖醛酸含量都明显高于传统水提法所提多糖。

表4.不同提取方法对诺丽多糖提取率，总糖含量和糖醛酸含量的影响

不同字母代表存在显著差异(p<0.05)

经测定诺丽多糖分子量大小结果如图3所示，由高效凝胶色谱结果可知，梯级物理场法所提诺丽多糖分子量大小为37.6kda，水热法所提诺丽多糖分子量为64.4kda。相较于水热法所提诺丽多糖，梯级物理场所提诺丽多糖分子量降低41.46％。水热法和梯级物理场法所提诺丽多糖抗氧化活性评价结果如表5所示。由表5可知，梯级物理场所提诺丽多糖在1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/ml浓度下dpph，abts，去羟基自由基清除率都要高于水热法所提诺丽多糖。说明在相同浓度下梯级物理场所提诺丽多糖比水热法所提诺丽多糖表现出更强的抗氧化活性。

诺丽多糖与锌元素螯合后，由ass元素分析仪测得两种诺丽多糖-锌螯合物中锌的含量。梯级物理场法所提诺丽多糖形成的螯合物中锌含量为5.98％，而水热法所提诺丽多糖形成的螯合物中锌含量仅为2.67％。相较于水热法所提诺丽多糖形成的螯合物，梯级物理场所提诺丽多糖对锌元素有更强的结合能力。

表5.水热法和梯级物理场法所提诺丽多糖抗氧化评价结果

多糖和多糖-锌螯合物抗癌效果结果如表6所示。

表6.两种诺丽多糖及其锌螯合物对人肝癌hepg2细胞存活率影响结果

两种方法所提诺丽多糖对人肝癌hepg2细胞都显示出一定的抑制效果，并且表现出剂量依赖性。其中，在所选浓度梯度下，添加了梯级物理场所提诺丽多糖的hepg2细胞存活率都比添加了水热法所提诺丽多糖低。具体表现为，在125，250，500ug/ml浓度下，添加梯级物理场所提诺丽多糖的hepg2细胞存活率分别为61.32％，45.23％，26.32％，而添加了水热法所提诺丽多糖的hepg2细胞存活率分别为82.12％，53.21％，45.13％。由实验结果知，梯级物理场所提诺丽多糖表现出更强的抗癌活性。

两种诺丽多糖与锌元素螯合后其抗癌效果有显著提升，并表现出剂量依赖性。在125，250，500ug/ml三个浓度下，水热法所提诺丽多糖螯合锌后，使人肝癌hepg2细胞存活率降低了17.98％，13.99％，2.28％。而梯级物理场所提诺丽多糖螯合锌后，使人肝癌hepg2细胞存活率降低了21.32％，20.16％，4.79％。由结果知，螯合锌后对梯级物理场所提诺丽多糖的抗癌活性增幅要大于水热法所提诺丽多糖，其原因主要是由于梯级物理场所提诺丽多糖对锌元素螯合能力更强，能够结合更多锌元素使其抗癌活性增强。

实施例3

如图1所示，一种梯级物理场制备高抗癌抗氧化活性诺丽多糖的方法，包括如下步骤：

诺丽果原料处理：将诺丽果(诺丽果为白熟阶段的成熟诺丽果实)45℃烘干打粉过筛(过100目筛)，按体积加入4倍75％乙醇溶液回流处理4h脱脂脱色后烘干即得诺丽果粉。

梯级物理场辅助提取诺丽多糖：取25g诺丽果粉按料液比1：25加入蒸馏水放入间断式脉冲电场提取设备中处理40次，脉冲频率为4hz，处理场强为6kv/cm，随后采用超声设备超声处理20min，超声功率为600w，超声频率40khz，温度维持在50℃。待超声处理完后转入连续式脉冲电场设备处理45min，场强25kv/cm，脉宽80us，频率1300hz。

处理完后，提取液4800rpm离心15min后取上清液合并得多糖粗提液，加入sevage试剂，sevage试剂的配制方法为将氯仿、正丁醇体积比为4.5：1混合，多糖粗提液与sevage试剂的体积比为1：5，涡旋振荡20min，去除沉淀，重复4次直至完全去除蛋白质无沉淀析出，往粗提液中加入4.5倍体积无水乙醇，在1℃下醇沉20h，随后离心分离，取沉淀冻干，得到诺丽多糖。

传统水提法提取诺丽多糖：取25g诺丽果粉按料液比1：25加入蒸馏水，60℃水浴提取2小时。处理完后，提取液4800rpm离心15min后取上清液合并得多糖粗提液，加入sevage试剂，sevage试剂的配制方法为将氯仿、正丁醇体积比为4.5：1混合，多糖粗提液与sevage试剂的体积比为1：5，涡旋振荡20min，去除沉淀，重复4次直至完全去除蛋白质无沉淀析出，往粗提液中加入4.5倍体积无水乙醇，在1℃下醇沉20h，随后离心分离，取沉淀冻干，得到诺丽多糖。

所得诺丽多糖的得率、总糖含量、糖醛酸含量、分子量大小、抗氧化活性、与锌元素结合能力、抗癌活性能指标按照实例1的方法进行检测。

经测定多糖提取率，总糖含量和糖醛酸含量如表7所示。由表7可知，梯级物理场诺丽多糖提取率为13.24％，相较于传统水提法提取率(6.67％)增加98.5％。其次，梯级物理场所提诺丽多糖中总糖含量高达87.13％，相较于传统水提法总糖含量(70.25％)增加24％，此外，梯级物理场所提诺丽多糖中糖醛酸含量为3.16％，相较于传统水提法糖醛酸含量(1.19％)增加165％。由结果可知，用梯级物理场提取诺丽多糖提取率远高于传统水提法，并且所提多糖总糖含量和糖醛酸含量都明显高于传统水提法所提多糖。

表7.不同提取方法对诺丽多糖提取率，总糖含量和糖醛酸含量的影响

不同字母代表存在显著差异(p<0.05)

经测定诺丽多糖分子量大小结果如图4所示，由高效凝胶色谱结果可知，梯级物理场法所提诺丽多糖分子量大小为33.45kda，水热法所提诺丽多糖分子量为58.8kda。相较于水热法所提诺丽多糖，梯级物理场所提诺丽多糖分子量降低43.11％。

水热法和梯级物理场法所提诺丽多糖抗氧化活性评价结果如表8所示。由表8可知，梯级物理场所提诺丽多糖在1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/ml浓度下dpph，abts，去羟基自由基清除率都要高于水热法所提诺丽多糖。说明在相同浓度下梯级物理场所提诺丽多糖比水热法所提诺丽多糖表现出更强的抗氧化活性。

表8.水热法和梯级物理场法所提诺丽多糖抗氧化评价结果

诺丽多糖与锌元素螯合后，由ass元素分析仪测得两种诺丽多糖-锌螯合物中锌的含量。梯级物理场法所提诺丽多糖形成的螯合物中锌含量为5.87％，而水热法所提诺丽多糖形成的螯合物中锌含量仅为2.59％。相较于水热法所提诺丽多糖形成的螯合物，梯级物理场所提诺丽多糖对锌元素有更强的结合能力。

多糖和多糖-锌螯合物抗癌效果结果如表9所示。

表9.两种诺丽多糖及其锌螯合物对人肝癌hepg2细胞存活率影响结果

两种方法所提诺丽多糖对人肝癌hepg2细胞都显示出一定的抑制效果，并且表现出剂量依赖性。其中，在所选浓度梯度下，添加了梯级物理场所提诺丽多糖的hepg2细胞存活率都比添加了水热法所提诺丽多糖低。具体表现为，在125，250，500ug/ml浓度下，添加梯级物理场所提诺丽多糖的hepg2细胞存活率分别为62.34％，44.23％，25.42％，而添加了水热法所提诺丽多糖的hepg2细胞存活率分别为83.09％，54.21％，43.08％。由实验结果知，梯级物理场所提诺丽多糖表现出更强的抗癌活性

两种诺丽多糖与锌元素螯合后其抗癌效果有显著提升，并表现出剂量依赖性。在125，250，500ug/ml三个浓度下，水热法所提诺丽多糖螯合锌后，使人肝癌hepg2细胞存活率降低了20.28％，9.97％，2.85％。而梯级物理场所提诺丽多糖螯合锌后，使人肝癌hepg2细胞存活率降低了21.23％，24.15％，7.28％。由结果知，螯合锌后对梯级物理场所提诺丽多糖的抗癌活性增幅要大于水热法所提诺丽多糖，其原因主要是由于梯级物理场所提诺丽多糖对锌元素螯合能力更强，能够结合更多锌元素使其抗癌活性增强。

本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。