海洋来源杂萜化合物I和II、制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用与流程

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及化合物i和ii及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

癌症正严重威胁着人类的健康。当前，抗肿瘤药物的市场份额也在不断扩大，抗癌药物占医药市场份额高达30％。然而，目前抗癌药物大多存在特异性差、毒副作用强和价格昂贵等缺陷，使得癌症患者常因药物昂贵而放弃治疗或副作用大而意外致死。因此，提高抗癌药物特异性从而降低毒副作用将造福癌症患者，对人类健康和社会发展有着十分重要的现实意义。抗癌药物的主要来源是天然产物及其衍生物。海洋微生物由于代谢产物丰富、生长迅速、需求简单、可再生以及目的化合物产量高等优点，正成为新颖天然药物发现的重要源泉。

技术实现要素：
：

本发明的第一个目的是提供具有抗肿瘤活性的海洋来源杂萜化合物i和ii。

本发明的杂萜化合物，其结构如式(i)中任一所示：

本发明的第二个目的是提供一种化合物i和ii的制备方法，该制备方法中所述的化合物i和ii是从海洋真菌phomopsistersafs441的发酵培养物中分离制备得到的，具体包括以下步骤：

(1)制备海洋真菌phomopsistersafs441的固体发酵培养物，用乙酸乙酯萃取该固体发酵培养物，将乙酸乙酯萃取液经浓缩后得浸膏；

(2)浸膏经过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以体积比为10:1，5:1，2:1，1:1，0:1和二氯甲烷-甲醇以体积比为10:1，5:1，0:1分别作为洗脱剂，梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比5:1洗脱获得的且经tlc薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝2:1v/v展开得rf＝0.3-0.4的组分fr.4；

将组分fr.4经反相柱色谱，用甲醇-水体积比70:30，80:20，90:10，100:0梯度洗脱，收集甲醇-水体积比80:20洗脱组分fr.4.8，收集甲醇-水体积比90:10洗脱组分fr.4.11；

组分fr.4.8经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇以体积比为30:1，20:1，10:1，5:1，2:1作为洗脱剂，梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比30:1洗脱获得的且经tlc薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1(v/v)展开得rf＝0.4-0.5的组分fr.4.8.1，fr.4.8.1再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇体积比40:1，30:1，20:1，10：1，5:1作为洗脱剂洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比30:1洗脱获得的并经tlc薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1(v/v)展开得rf＝0.4-0.5的组分fr.4.8.1.2，将组分fr.4.8.1.2用hplc分离纯化，得到化合物ii；

组分fr.4.11经凝胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇体积比1:1进行洗脱，洗脱物经tlc薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1(v/v)展开得rf＝0.3-0.4的组分组分fr.4.11.3用hplc分离纯化，得到化合物i。

所述的制备海洋真菌phomopsistersafs441的固体发酵培养物具体步骤为：挑取fs441的菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按0.1ml/g的接种量接种于大米培养基中，28℃条件下培养30天，制得fs441的固体发酵培养物，所述的马铃薯葡萄糖液体培养基，每升是通过以下方法配制的：用500ml的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、维生素b110mg，用水补足至1000ml，灭菌制得；所述的大米培养基是通过以下方法配制的：按每280g大米与300ml质量体积比为0.5％g/ml的粗海盐水溶液混合灭菌制得。

本发明的第三个目的是提供化合物i和/或ii，或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的抗肿瘤药物优选为抗肝癌、乳腺癌、神经胶质瘤或非小细胞肺癌药物。

本发明通过实验发现，化合物i和ii对肝癌细胞hepg-2、乳腺癌细胞mcf-7、神经胶质瘤细胞sf-268和非小细胞肺癌细胞a549的ic50值范围为0.5～17.6μm。阳性对照物阿霉素对以上四种肿瘤细胞株的ic50值分别为1.2、1.5、1.1和1.4μm。此结果表明：本发明的化合物i和ii均具有比较显著的抗肿瘤活性。

本发明的第四个目的是提供一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物包含化合物i和ii中的至少一种，或其药用盐作为活性成分。优选，所述的抗肿瘤药物为抗肝癌、乳腺癌、神经胶质瘤或非小细胞肺癌药物。

本发明的第五个目的是提供海洋真菌phomopsistersafs441在制备化合物i和/或ii中的应用。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

本发明从海洋真菌phomopsistersafs441中分离制备得到化合物i和ii，该类化合物i和ii具有比较显著的抗肿瘤活性，可以用于制备抗肿瘤药物，为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用海洋微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。

本发明的海洋真菌phomopsistersafs441已公开于shanchongchen,zhaomingliu,haibotan,yuchanchen,sainili,haohuali,h.guo,shuangzhu,hongxinliu,weiminzhang.tersonea-g,newpyridonealkaloidsfromthedeep-seafungusphomopsistersa.marinedrugs,2019,17,394。该菌株本申请人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。

附图说明

图1是化合物i的¹hnmr谱；

图2是化合物i的¹³cnmr谱；

图3是化合物i的dept谱；

图4是化合物i的hsqc谱；

图5是化合物i的hmbc谱；

图6是化合物i的noesy谱；

图7是化合物i的hr-esims谱；

图8是化合物i的cd谱；

图9是化合物i的uv谱；

图10是化合物i的ir谱；

图11是化合物ii的¹hnmr谱；

图12是化合物ii的¹³cnmr谱；

图13是化合物ii的cosy谱；

图14是化合物ii的hsqc谱；

图15是化合物ii的hmbc谱；

图16是化合物ii的noesy谱

图17是化合物ii的hr-esims谱；

图18是化合物ii的cd谱；

图19是化合物ii的uv谱；

图20是化合物ii的ir谱；

图21是化合物i(1)和ii(2)的¹h-¹hcosy和hmbc相关图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

1、海洋真菌phomopsistersafs441的分离纯化和鉴定

本发明的海洋真菌phomopsistersafs441是2016年5月，从印度洋深海沉积物(88°58.640'n,0°00.307'e，水深3000米)中分离得到的，经its序列分析鉴定，genbank基因登录号为：mk592793，经blast比对，同源分析，鉴定该菌株属于phomopsis属真菌，命名为phomopsistersafs441。

2、phomopsistersafs441的固体发酵

将活化的深海真菌phomopsistersafs441菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基(每升培养基是通过以下方法配制的：用500ml的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、维生素b110mg，用水补足至1000ml，灭菌制得)中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按0.1ml/g大米培养基的接种量接种于大米培养基(该培养基是通过以下方法配制的：将280g大米与300ml质量体积比为0.5％mg/ml的粗海盐水溶液混合，121℃高压灭菌20min，冷却，制得)中，28℃条件下培养30天，制得fs441的固体发酵培养物。

3、化合物i和/或ii的制备

(1)往fs441的固体发酵培养物中加入乙酸乙酯，浸泡提取24小时，重复提取3次，提取液合并后经浓缩后得浸膏(177.9g)。

(2)浸膏经过硅胶柱层析(直径8cm玻璃柱，100-200目硅胶)，用石油醚-乙酸乙酯以体积比为10:1，5:1，2:1，1:1，0:1和二氯甲烷-甲醇以体积比为10:1，5:1，0:1分别作为洗脱剂，梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比5:1洗脱获得的且经tlc薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝2:1v/v展开得rf＝0.3-0.4的组分fr.4；

将组分fr.4(41.8g)经反相柱色谱(直径3.5cm玻璃柱，填料为rp-c18反相硅胶)，用甲醇-水70:30，80:20，90:10，100:0v/v梯度洗脱，得到15个亚组分fr.4.1-fr.4.15。收集甲醇-水80:20v/v洗脱下来的组分fr.4.8，收集甲醇-水体积比90:10洗脱下来的组分fr.4.11；

组分fr.4.8再经硅胶柱色谱(直径2.5cm玻璃柱，100-200目硅胶)，用二氯甲烷-甲醇以体积比为30:1，20:1，10:1，5:1，2:1作为洗脱剂，梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比30:1洗脱获得的且经tlc薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1(v/v)展开得rf＝0.4-0.5的组分fr.4.8.1，fr.4.8.1再经硅胶柱色谱(直径2.5cm玻璃柱，100-200目硅胶)，以二氯甲烷-甲醇体积比40:1，30:1，20:1，10:1，5:1作为洗脱剂洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比30:1洗脱获得的并经tlc薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1(v/v)展开得rf＝0.4-0.5的组分fr.4.8.1.2，将组分fr.4.8.1.2经半制备hplc在ymc-ods-a/aq柱，流动相为体积比60:40的乙腈/水，流速为2ml/min，收集保留时间为34.8min的洗脱组分，得到化合物ii。

组分fr.4.11经凝胶柱色谱(sephadexlh-20)，以二氯甲烷-甲醇体积比1:1进行洗脱，洗脱的组分经tlc薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1(v/v)展开得rf＝0.3-0.4的组分fr.4.11.3，fr.4.11.3经半制备hplc，使用ymc-ods-a/aq柱，流动相为体积比60:40的甲醇/水，流速为2ml/min，收集保留时间为40.7min的洗脱组分，得到化合物i。

4、化合物i和ii的结构鉴定

¹h-nmr、¹³c-nmr、hmbc核磁共振谱图用brukeradvance-600核磁共振光谱仪测定，以四甲基硅烷(tms)为内标；esi-ms数据用vgautospec-3000型质谱仪测定；紫外光谱用岛津uv-2600分光光度计测定，其结构鉴定如下：

如图1-21所示，图1是化合物i的¹hnmr谱；图2是化合物i的¹³cnmr谱；图3是化合物i的cosy谱；图4是化合物i的hsqc谱；图5是化合物i的hmbc谱；图6是化合物i的noesy谱；图7是化合物i的hr-esims谱；图8是化合物i的cd谱；图9是化合物i的uv谱；图10是化合物i的ir谱；

图11是化合物ii的¹hnmr谱；图12是化合物ii的¹³cnmr谱；图13是化合物ii的cosy谱；图14是化合物ii的hsqc谱；图15是化合物ii的hmbc谱；图16是化合物ii的noesy谱图17是化合物ii的hr-esims谱；图18是化合物ii的cd谱；图19是化合物ii的uv谱；图20是化合物ii的ir谱。

化合物i为黄色粉末(其核磁数据如表1所示)；根据hresims[m–h]^–m/z535.2723，c23h33o3，计算值为535.2701，确定化合物的分子式为c32h40o7，不饱和度为13；1h-nmr谱显示一个典型的四取代苯环信号[δh6.16(1h,d,j＝2.4hz,h-28),6.27(1h,d,j＝2.4hz,h-30)]以及6个甲基氢信号[δh1.43(3h,s,h3-20),1.01(3h,s,h3-21),1.09(3h,s,h3-22),1.02(3h,s,h3-23),1.54(3h,d,j＝1.5hz,h3-24),2.10(3h,s,h3-32)]。¹³c-nmr谱以及dept谱显示有32个碳信号(表2)，包括12个季碳(包括6个连氧季碳)，9个次甲基，5个亚甲基，以及6个甲基。化合物i的平面结构结构通过进一步分析其cosy、hsqc以及hmbc等二维谱图得以确定(图21)，化合物i的绝对构型是通过计算ecd法得以确定。

化合物ii为黄色粉末(其核磁数据如表1所示)；根据高分辨质谱(hresims)[m+h]⁺m/z595.2906，c34h43o9，计算值为595.2902，确定化合物的分子式为c34h42o9，不饱和度为14；通过分析其1d和2d谱图发现化合物ii的谱图与化合物i的谱图具有极大的相似度，化合物ii具有与化合物i相同的b-d环系。进一步通过仔细分析化合物ii的hmbc和cosy相关谱图推测出化合物ii和化合物i之间的差别主要存在于a环和e环上。a环由苯环变成了庚三烯环，e环则为一个furan-2(5h)-one环，通过系统分析其二维谱确定了化合物ii的平面结构。化合物ii的绝对构型是通过分析其noesy谱及计算ecd法进行确定的。

表1化合物i和ii的核磁数据(600mhz/150mhz,δinppm,jinhz)

^acd3cocd3.^bcdcl3

经过上述方法分离的目标化合物i和ii的结构式如式(i)所示：

实施例2

采用srb法(skehanp,storengr,dominics.newcolorimetriccytotoxicityassayforanticancer-drugscreening[j].jnatlcanceinst,1990,82:1107–1112.)测试化合物i和ii的抗肿瘤活性。

1、试验用试剂：将本发明制备的化合物i和ii用二甲基亚砜(dmso)溶解得浓度为10mg/ml的母液，再用rpmi-1640培养基稀释至所需浓度。阳性对照为顺铂水溶液。

本实验所用肿瘤细胞株为肝癌细胞hepg-2、乳腺癌细胞mcf-7、神经胶质瘤细胞sf-268和非小细胞肺癌细胞a549。

2、实验方法：取对数生长期的hepg-2、mcf-7、sf-268和a549细胞，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95％后，用新鲜rpmi-1640培养基调整细胞浓度为3×10⁴个/ml，细胞接种于96孔板，每孔加入180μl的细胞悬液，并设3个空白孔调零，于37℃、5％co2培养箱培养24h。待细胞贴壁后，每孔加入20μl一定浓度的上述化合物化合物i和ii的溶液，阴性对照加20μlrpmi-1640培养基，以阿霉素作阳性对照，每个做三个重复。置于37℃、5％co2培养箱中培养72h后，加入50μl体积分数为50％的冷三氯醋酸水溶液固定细胞，4℃放置1h后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由体积分数1％冰醋酸水溶液配制的磺酰罗丹明b(sulforhodamineb，srb)4mg/ml溶液100μl/孔，室温中染色30min，去上清，用1％冰醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入200μl/孔，浓度为10mmol/ml的tris溶液，用酶标仪测定570nm处的吸光值(a)，用以下公式计算药物对细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率(％)＝(1-a样品组/a对照组)×100％。

3、实验结果：本发明制备的化合物i和ii对四株肿瘤细胞的细胞毒性如表2所示。此结果表明：本发明的化合物i和ii具有比较显著的抗肿瘤活性，因此，本发明为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用深海微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。

表2化合物i和ii的对癌细胞的抑制效果

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。