Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用与流程

本发明属于生物技术和植物基因工程
技术领域：
，尤其涉及一种gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用。
背景技术：
：目前，最接近的现有技术：转基因技术自20世纪80年代初开始，逐步发展为一种在生物领域应用最广泛的基因研究方法，可通过农杆菌介导转化、花粉管通道法、基因枪法等技术将人工分离和修饰过的优质基因导入到植物基因组中，达到改造植物的目的。转基因技术可快速实现目标性状的改良，具有可用基因资源广、改良效率高等优点，为农作物产量及品质的提升、抗逆性的增强提供了新的路径。基因载体作为基因导入细胞的工具，对转基因的成败起到决定性的作用。双元表达载体系统在植物基因工程中应用最为广泛，是指农杆菌中用于把t-dna区域转入受体细胞的双质粒系统，其中一个质粒具有改造过的t-dna区域，用于携带外源基因；另一个质粒带有毒性基因，用于t-dna的转移。构建植物过表达载体可通过酶切连接的方式，如pcambia系列，pri系列载体等，也可以通过gateway技术构建载体，如pearlygate等系列载体。选择合适的过表达载体，对于转基因的发展具有重要作用。选择过表达载体时通常需要考虑以下几个问题：1、载体的筛选标记，以便于转基因株系的筛选鉴定；2、启动外源基因的强弱，通常选用35s启动子、nos(nopalinesynthase)启动子、基因本身启动子等；3、是否有标签蛋白与过表达基因融合，便于过表达后蛋白水平的鉴定及后续实验，通常选用的标签蛋白有myc、flag、ha、gfp(greenfluorescentprotein)、yfp(yellowfluorescentprotein)等。在转基因过程中，抗生素抗性基因是主要的筛选标记，通常在表达载体中具有表达某种抗生素的抗性基因，如卡那霉素(kana)抗性基因、basta抗性基因、潮霉素抗性基因等。但是不同的植物对于不同的抗生素具有一定的敏感性，如苹果转基因通常采用卡那霉素作为筛选标记。另外，也可以通过一些荧光蛋白等作为筛选标记，如gfp。gateway技术利用位点特异重组，在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶，达到快速简便的构建各种表达载体。在一般使用的大肠杆菌中，如top10、dh5α等，gateway系列载体因具有ccdb毒性蛋白而将其杀死，因此，该系列载体只能在特定的大肠杆菌中复制，如db3.1。gateway技术可通过bp或lr反应将ccdb基因置换，保证构建成功的载体在top10、dh5α等大肠杆菌中正常复制，ccdb基因能够产生毒蛋白而无法使菌存活，而原始载体则因为ccdb基因的表达而使这些大肠杆菌致死。综上所述，现有技术存在的问题是：pearlygate系列载体由于其过表达能力强、利用gateway技术快速简便的构建载体、具有标签蛋白等，广泛应用于拟南芥的遗传转化中。但是由于其筛选标记是basta，无法应用于苹果的遗传转化。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用。本发明是这样实现的，一种gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法，所述gateway克隆系统的植物表达载体pkgmyc的构建方法将pearleygate203的35s-myc-attr1-ccdb-attr2-ocsterminal片段置换pk7gwiwg2d(ii)部分片段形成pkgmyc；所述gateway克隆系统的植物表达载体pkcyfp和pknyfp载体的构建方法包括：将pearleygate101的35s-attr1-ccdb-attr2-yfp-ha-ocsterminal或pearleygate104的35s-yfp-attr1-ccdb-attr2-ocsterminal片段置换pk2gw7的部分片段，分别形成pkcyfp和pknyfp。进一步，所述gateway克隆系统的植物表达载体pkgmyc的构建方法具体包括：(1)设计引物；seqidno：4和seqidno：5；使用nebphusion高保真聚合酶，以pearleygate203为模板，扩增得到片段f1；pcr反应程序为98℃30s；98℃10s，62℃30s，72℃4min，32个循环；72℃10min；(2)使用saci-hf和kpni-hf核酸内切酶在37℃培养箱酶切pk7gwiwg2d(ii)载体30min；(3)pcr及酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，并使用thermoscientific的genejetgelextractionkit并按照试剂盒说明书回收dna片段；(4)使用vazyme公司的clonexpressiionestepcloningkit并按照说明书进行连接；37℃反应30min；(5)连接完成后，将连接产物转化db3.1热激感受态，同时转化top10热激感受态，检测ccdb致死情况；转化完成后涂布于spec抗性的lb固体培养基，37℃倒置培养12-16h；第二天挑取单克隆，并用spec抗性的lb液体培养基摇菌12h，使用天根质粒小提中量试剂盒提取质粒，并测序。进一步，所述gateway克隆系统的植物表达载体pkcyfp和pknyfp载体的构建方法具体包括：设计引物；seqidno：6和seqidno：7；使用nebphusion高保真聚合酶，以pearleygate101或pearleygate104为模板，分别扩增得到片段f2和f3；使用neb公司的saci-hf和pmei核酸内切酶在37℃培养箱酶切pk2gw7载体30min；pcr及酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，并使用thermoscientific的genejetgelextractionkit回收dna片段；将pearleygate101为模板的扩增片段与pk2gw7酶切片段连接，得到pkcyfp，将pearleygate104为模板的扩增片段与pk2gw7酶切片段连接，得到pknyfp；质粒提取后，测序。本发明的另一目的在于提供一种所述gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法的测序引物，所述gateway克隆系统的植物表达载体测序引物的序列为：载体pkgmyc测序引物为使用sp1的序列为seqidno：8；sp2的序列为seqidno：9；sp3的序列为seqidno：10；sp4的序列为seqidno：11；sp7的序列为seqidno：14；sp8的序列为seqidno：15；pkcyfp载体的测序引物为sp2的序列为seqidno：9；sp3的序列为seqidno：10；sp4的序列为seqidno：11；sp5的序列为seqidno：12；sp6的序列为seqidno：13；sp7的序列为seqidno：14；sp9的序列为seqidno：16；pknyfp载体的测序引物为sp2的序列为seqidno：9；sp3的序列为seqidno：10；sp4的序列为seqidno：11；sp5的序列为seqidno：12；sp6的序列为seqidno：13；sp7的序列为seqidno：14；sp8的序列为seqidno：15；sp9的序列为seqidno：16。本发明的另一目的在于提供一种由所述gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法构建的gateway克隆系统的植物表达载体，所述gateway克隆系统的植物表达载体分别为pkgmyc，pknyfp和pkcyfp；pkgmyc的序列为seqidno：1；pknyfp的序列为seqidno：2；pkcyfp的序列为seqidno：3。本发明的另一目的在于提供一种所述gateway克隆系统的植物表达载体在转基因技术中的应用。综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明改变该系列载体的筛选标记，可将其应用于其它植物的转基因，促进转基因技术的发展。本发明提供三种gateway克隆系统的植物表达载体分别为pkgmyc，pknyfp和pkcyfp；三种载体在植物中具有kana(kanamycin，卡那霉素)抗性筛选标记和荧光筛选标记，其中，pkgmyc的gfp荧光蛋白为非融合蛋白，另外两种载体的yfp荧光蛋白与目的表达基因为融合蛋白。同时，这三个载体在菌中的抗性筛选标记为spec(spectinomycin，壮观霉素)，避免与中间载体pdonr222等载体的抗性相同，简化了lr反应过程。本发明的载体的构建方法，以pk7gwiwg2d(ii)或pk2gw7为骨架，这两个载体分别使用saci/kpni和saci/pmei核酸内切酶进行双酶切；通过同源重组技术将其他gateway系列载体构建入这两个载体，形成以卡那霉素为筛选标记的植物表达载体；同时，pk7gwiwg2d(ii),0为骨架的改造载体还具有非融合的gfp荧光蛋白筛选标记。本发明的pearlygate系列载体由于其过表达能力强、利用gateway技术快速简便的构建载体、具有标签蛋白等，广泛应用于拟南芥的遗传转化中。但是由于其筛选标记是basta，无法应用于苹果的遗传转化，因此，改变该系列载体的筛选标记，可将其应用于其它植物的转基因，促进转基因技术的发展。附图说明图1是本发明实施例提供的gateway克隆系统的植物表达载体pkgmyc的构建方法流程图。图2是本发明实施例提供的pkcyfp改造示意图。图3是本发明实施例提供的pknyfp改造示意图。图4是本发明实施例提供的pkgmyc改造示意图。图5是本发明实施例提供的改造的三个载体转化db3.1和top10菌株生长情况示意图。图6是本发明实施例提供的pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；图中：f1:pearlygate203为模板扩增片段；f2:pearlygate101为模板扩增片段；f3:pearlygate104为模板扩增片段；m：marker。图7是本发明实施例提供的酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；图中：1：pk7gwiwg2d(ii)载体，2：pk7gwiwg2d(ii)载体经saci/kpni双酶切，3：pk2gw7载体，4：pk2gw7载体经saci/pmei双酶切，m：marker。图8是本发明实施例提供的westernblot检测pkgmyc-a载体表达myc情况示意图。图9是本发明实施例提供的pkgmyc-a载体非融合gfp蛋白荧光观察示意图。图10是本发明实施例提供的pkcyfp-a载体融合yfp蛋白荧光观察示意图。图11是本发明实施例提供的pknyfp-a载体融合yfp蛋白荧光观察示意图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。现有gateway技术可通过bp或lr反应将ccdb基因置换，保证构建成功的载体在top10、dh5α等大肠杆菌中正常复制，而原始载体则因为ccdb基因的表达而使大肠杆菌致死的问题。本发明三个载体在菌中的抗性筛选标记为spec(spectinomycin，壮观霉素)，避免与中间载体pdonr222等载体的抗性相同，简化了lr反应过程。下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。本发明提供三种gateway克隆系统的植物表达载体分别为pkgmyc，pknyfp和pkcyfp。pkgmyc的序列为seqidno：1。pknyfp的序列为seqidno：2。pkcyfp的序列为seqidno：3。如图1所示，本发明实施例提供的gateway克隆系统的植物表达载体pkgmyc的构建方法具体包括：s101：设计引物；seqidno：4和seqidno：5；使用nebphusion高保真聚合酶，以pearleygate203为模板，扩增得到片段f1；pcr反应程序为98℃30s；98℃10s，62℃30s，72℃4min，32个循环；72℃10min；s102：使用saci-hf和kpni-hf核酸内切酶在37℃培养箱酶切pk7gwiwg2d(ii)载体30min；s103：pcr及酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，并使用thermoscientific的genejetgelextractionkit并按照试剂盒说明书回收dna片段；s104：使用vazyme公司的clonexpressiionestepcloningkit并按照说明书进行连接；37℃反应30min；s105：连接完成后，将连接产物转化db3.1热激感受态，同时转化top10热激感受态，检测ccdb致死情况；转化完成后涂布于spec抗性的lb固体培养基，37℃倒置培养12-16h；第二天挑取单克隆，并用spec抗性的lb液体培养基摇菌12h，使用天根质粒小提中量试剂盒提取质粒，并测序。下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。本发明的实施例中所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。其中，载体pk7gwiwg2d(ii)和pk2gw7可从网站https://gateway.psb.ugent.be订购；pearleygate101、pearleygate104和pearleygate203可从tair(https://www.arabidopsis.org/)订购。(一)pkgmyc载体构建：设计引物；seqidno：4：primer-f1:5’-ctgcaggcatgcaagcttgagctcccagccccaaaagagatctcc-3’seqidno：5：primer-r1：5’-ttctcatgtataattcgcggtaccctgctgagcctcgacatgttg-3’；并通过生工生物合成。使用nebphusion高保真聚合酶，以pearleygate203为模板，扩增得到片段f1(图红色片段)。体系如下：表1pcr反应程序为98℃30s；98℃10s，62℃30s，72℃4min，32个循环；72℃10min。使用neb公司的saci-hf和kpni-hf核酸内切酶在37℃培养箱酶切pk7gwiwg2d(ii)载体30min，反应体系如下：表2pk7gwiwg2d(ii)质粒1μgsaci-hf1μlkpni-hf1μl10*cutsmartbuffer5μlddh2oto50μlpcr及酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，并使用thermoscientific的genejetgelextractionkit并按照试剂盒说明书回收dna片段。使用vazyme公司的clonexpressiionestepcloningkit并按照说明书进行连接。反应体系如下：表3线性化克隆载体2μlpcr扩增插入片段2μl5*ceiibuffer2μlexnaseii1μlddh2o3μl37℃反应30min；连接完成后，将连接产物转化db3.1热激感受态(全式金公司，transdb3.1chemicallycompetentcell，货号cd531-01)，同时转化top10热激感受态(康为世纪，货号cw0807)，检测ccdb致死情况；转化完成后涂布于spec抗性的lb固体培养基，37℃倒置培养12-16h；第二天挑取单克隆，并用spec抗性的lb液体培养基摇菌12h，使用天根质粒小提中量试剂盒提取质粒，并测序。测序引物使用sp1，sp2，sp3，sp4，sp7，sp8。(二)pkcyfp和pknyfp载体构建设计引物；seqidno：6：primer-f1:5’-tcatgtatgataattcgagctcgcccagcagtgatccagc-3’，seqidno：7：primer-r1：5’-tgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatct-3’；并通过生工生物合成。使用nebphusion高保真聚合酶，以pearleygate101或pearleygate104为模板，分别扩增得到片段f2和f3(图红色片段)。体系及反应条件同上。使用neb公司的saci-hf和pmei核酸内切酶在37℃培养箱酶切pk2gw7载体30min，反应体系如下：表4pk2gw7质粒1μgsaci-hf1μlpmei1μl10*cutsmartbuffer5μlddh2oto50μlpcr及酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，并使用thermoscientific的genejetgelextractionkit并按照试剂盒说明书回收dna片段。将pearleygate101为模板的扩增片段与pk2gw7酶切片段连接，得到pkcyfp，将pearleygate104为模板的扩增片段与pk2gw7酶切片段连接，得到pknyfp。连接、转化方法同上。质粒提取后，送上海生工测序。pkcyfp测序引物使用sp2，sp3，sp4，sp5，sp6，sp7，sp9；pknyfp测序引物使用sp2，sp3，sp4，sp5，sp6，sp7，sp8，sp9。表5加测引物(sequenceprimer)序列表sp1的序列为seqidno：8；sp2的序列为seqidno：9；sp3的序列为seqidno：10；sp4的序列为seqidno：11；sp5的序列为seqidno：12；sp6的序列为seqidno：13；sp7的序列为seqidno：14；sp8的序列为seqidno：15；sp9的序列为seqidno：16。(三)目的基因连接改造载体，并检测荧光及myc标签表达(如图8-图11所示)；首先，选用一个在核中定位的转录因子a，通过bp反应将a基因构建到中间载体pdonr222，形成pdonr222-a-withstopcodon和pdonr222-a-nostopcodon载体，将pdonr222-a-withstopcodon通过lr反应连接pkgmyc和pknyfp，pdonr222-a-nostopcodon通过lr反应连接pkcyfp。提取质粒后通过电击法转化农杆菌c58c1，同时活化c58c1-p19。28℃倒置培养3d后，使用重悬液将菌体重悬，并调至od＝0.5。将每个菌液同p19等体积混合后注射烟草。农杆菌侵染三天后使用荧光显微镜(奥林巴斯，bx51+dp70)观察荧光。同时，采取注射pkgmyc-a的烟草叶片和未注射的烟草叶片准备westernblot分析。使用蛋白提取液提取研磨至粉末状的烟草叶片。加入sdsloadingbuffer，并100℃变性5min，瞬时离心后点样。120v电泳至loadingbuffer到达page胶底部，然后200ma转膜2h。使用封闭液室温封闭2h，myc一抗4℃孵育6h，二抗室温孵育2h，然后加入发光液发光检测myc标签表达情况。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>管清美，牛春东，曹富国，施焕然，陈鹏翔<120>gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>10108<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1attcgggcacgaacccagtggacataagcctcgttcggttcgtaagctgtaatgcaagta60gcgtaactgccgtcacgcaactggtccagaaccttgaccgaacgcagcggtggtaacggc120gcagtggcggttttcatggcttcttgttatgacatgtttttttggggtacagtctatgcc180tcgggcatccaagcagcaagcgcgttacgccgtgggtcgatgtttgatgttatggagcag240caacgatgttacgcagcagggcagtcgccctaaaacaaagttaaacatcatgggggaagc300ggtgatcgccgaagtatcgactcaactatcagaggtagttggcgtcatcgagcgccatct360cgaaccgacgttgctggccgtacatttgtacggctccgcagtggatggcggcctgaagcc420acacagtgatattgatttgctggttacggtgaccgtaaggcttgatgaaacaacgcggcg480agctttgatcaacgaccttttggaaacttcggcttcccctggagagagcgagattctccg540cgctgtagaagtcaccattgttgtgcacgacgacatcattccgtggcgttatccagctaa600gcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattcttgcaggtatcttcgagcc660agccacgatcgacattgatctggctatcttgctgacaaaagcaagagaacatagcgttgc720cttggtaggtccagcggcggaggaactctttgatccggttcctgaacaggatctatttga780ggcgctaaatgaaaccttaacgctatggaactcgccgcccgactgggctggcgatgagcg840aaatgtagtgcttacgttgtcccgcatttggtacagcgcagtaaccggcaaaatcgcgcc900gaaggatgtcgctgccgactgggcaatggagcgcctgccggcccagtatcagcccgtcat960acttgaagctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcctcgcgcgcaga1020tcagttggaagaatttgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaaggtagtcggcaaata1080atgtctagctagaaattcgttcaagccgacgccgcttcgccggcgttaactcaagcgatt1140agatgcactaagcacataattgctcacagccaaactatcaggtcaagtctgcttttatta1200tttttaagcgtgcataataagccctacacaaattgggagatatatcatgcatgaccaaaa1260tcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggat1320cttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgc1380taccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactg1440gcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccacc1500acttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtgg1560ctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccgg1620ataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaa1680cgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccg1740aagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacga1800gggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctct1860gacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgcca1920gcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttc1980ctgcgttatccc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