一种11-脱氢血栓烷B2抗原及其制备方法与流程

本发明属体外诊断领域，具体来说是一种11-脱氢血栓烷b2抗原及其制备方法，应用于人体尿液样本中11-脱氢-血栓烷b2的定量检测。

背景技术：

血栓烷a2(thromboxanea2，txa2)是人体血液中已知最强的血小板凝集剂，血液中txa2含量与粥样硬化血栓的形成密切相关，其值在一定程度上可以反映患者发生心脑血管意外(如脑卒中、心肌梗死等)的风险。阿司匹林(aspirin)类药物可以抑制血小板环氧合酶-1(cox-1)和血小板环氧合酶-2(cox-2)的活性，进而降低患者血液中txa2的含量，减少血小板异常凝集。所以，阿司匹林成为目前心脑血管疾病治疗的一个重要药物；同时，长期服用低剂量的阿司匹林也是预防心脑血管疾病的有效手段。

然而，阿司匹林抑制血小板凝集的作用并非对所有人都有效。相关统计结果显示，约25%的患者长期服用常规计量的阿司匹林，但不能有效减少体内txa2的生成量，此现象被称为“阿司匹林抵抗（aspirinresistance）”。所以，临床医生需要一种可靠的方式来分析个体对阿司匹林的特异反应，帮助医生判断治疗情况，据此调节个体的治疗方案。不幸的是，txa2在血液中半衰期仅为30秒，临床上对血液中的txa2含量分析非常困难。

11-脱氢-血栓烷b2(11-dehydro-thromboxaneb2,11-dhtxb2)是txa2在尿液中的代谢产物，尿液中11-dhtxb2含量能精准反映患者体内txa2的生物合成水平。所以，可以通过测定尿液中的11-dhtxb2含量评估患者血小板活化水平，帮助医生确定抗血小板凝集治疗效果；进一步可对患者发生脑卒中等心脑血管意外的风险进行预测，以达到及时采取治疗措施的目的。

11-dhtxb2为小分子化合物，在尿液中浓度极低，临床上测定主要依靠于免疫竞争法，检测的核心定量环节是标记抗原与待检抗原被抗体“捕捉”的竞争反应。检测所使用的标记抗原一般为11-dhtxb2与酶通过偶联反应制得的偶联物。然而，使用这样的标记抗原在制备和使用过程中存在一些问题：（1）偶联反应和抗原纯化过程中，标记酶的活性可能下降；（2）偶联反应位点具有不确定性，所制得标记抗原的化学结构不一致，批次差异大，检测试剂（盒）的批间差难以调控；（3）标记抗原上会不可避免地链接多个11-dhtxb2分子，在检测过程中必然消耗大于1当量的11-dhtxb2抗体，检测系统的分析灵敏度难以达到较高的水平；（4）基于酶的抗原相对分子质量较高，其空间位阻和扩散行为相对于小分子11-dhtxb2差异明显，抗体对二者的亲和力会产生差距，限制了检测系统的线性范围。

技术实现要素：

针对以上技术缺陷，本发明提供一种11-脱氢-血栓烷b2标记抗原及其制备方法，用于11-脱氢-血栓烷b2的定量检测，其特征是抗原分子中同时含有六聚组氨酸和生物素结构。本发明所提供的11-脱氢-血栓烷b2标记抗原具有化学结构明确、易于分离纯化、与抗体亲和能力较强等特点，适合大规模生产并可提高检测系统的性能。

具体来说，本发明的内容包括：

[1]一种用于11-脱氢-血栓烷b2定量检测的标记抗原，其特征是抗原分子中同时包含11-脱氢-血栓烷b2、六聚组氨酸、生物素三部分，其结构式为：

；

[2]一种权利要求[1]所述的用于11-脱氢-血栓烷b2定量检测的标记抗原的制备方法，其特征是在制备过程中使用ni亲和层析柱纯化，包括以下步骤：

（1）在溶剂中加入11-脱氢-血栓烷b2和加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），其混合均匀后，加入六聚组氨酸，应0.5~2小时后，用ni亲和层析柱纯化，得到11-脱氢-血栓烷b2与六聚组氨酸偶联物，其中，11-脱氢-血栓烷b2和六聚组氨酸的投料比为1:1.05~1:1.4；

（2）在溶剂中加入11-脱氢-血栓烷b2与六聚组氨酸偶联物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），其混合均匀后，加入氨基化生物素，反应0.5~2小时后，用ni亲和层析柱纯化，得到11-脱氢-血栓烷b2标记抗原，其中11-脱氢-血栓烷b2与六聚组氨酸偶联物和氨基化生物素的投料比为1:1.2~1:2.0；

[3]权利要求[1]所述的制备方法的化学反应方程式为：

附图说明

图1.标记抗原合成反应的化学方程式

图2.标记抗原的化学结构式

图3.实施例3中相关性检测

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，并对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施案例中所使用的试剂如表一所示

表一：实施例中试剂来源

实施例1：11-脱氢-血栓烷b2抗原的制备

在3mldmf中加入1mg11-脱氢-血栓烷b2和0.85mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，震荡均匀，再加入2mg六聚组氨酸，震荡2h，纯化水稀释50倍，用ni亲和层析柱纯化，浓缩，得到11-脱氢-血栓烷b2与六聚组氨酸偶联物，产率85%；

将1mg六聚组氨酸与11-脱氢-血栓烷b2偶联物溶解于5mldmf，加入0.18mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，震荡，加入0.48mg氨基化生物素，震荡2h，纯化水稀释20倍，用ni亲和层析柱纯化，得到11-脱氢-血栓烷b2标记抗原，产率71%；

综合产率60%。

化学反应方程式如图1所示；产物11-脱氢-血栓烷b2抗原的化学结构如图2所示。

实施例2：11-脱氢-血栓烷b2抗原用于临床检测

按下表配方制备试剂，并组合为11-脱氢-血栓烷b2检测试剂盒

按以下步骤，使用实施例1中所制备的11-脱氢-血栓烷b2标记抗原测定11-脱氢-血栓烷b2：

[1]将50ul待检样本（标准品）加入羊抗鼠包被的96孔微量滴定板中；

[2]再依次加入50ul11-脱氢-血栓烷b2标记抗原和50ul鼠源11-脱氢-血栓烷b2单克隆抗体，37℃孵育30min，清洗微孔；

[3]加入50ul链霉亲和素与碱性磷酸酶偶联物，37℃孵育30min，清洗微孔；

[4]加入150ulp-硝基苯磷酸溶液，37℃避光孵育10min；

[5]加入50ul乙二胺四乙酸溶液终止反应；

[6]在405nm出读数，绘制标准曲线。

使用hplc法和上述方法，同时测定50例人体尿液样本中的11-脱氢-血栓烷b2含量，以检测本发明所提供的标记抗原的可靠性。实验结果如图3所示，本发明提供的标记抗原测定与hplc法测定的结果具有良好的相关性，说明检测结果可靠。