本发明属于医药化学领域，涉及具有抗乙型肝炎病毒(hbv)活性的二氢喹嗪酮羧酸类化合物及其制备方法，以及含有它们的抗hbv感染的药物组合物。
背景技术：
：慢性乙型肝炎病毒(hbv)感染是全球重大公共卫生问题。据估计，hbv的感染率约占全球人口的5％，每年死于hbv感染及其相关性肝脏疾病者约100万例。目前临床用抗hbv感染药物包括干扰素(免疫调节剂)核苷类药物(聚合酶抑制剂)。尽管这些药物可明显降低病毒载量(hbvdna)并防止肝脏疾病的进展，但不能治愈hbv感染。因此，发现和开发具有全新作用机制的抗hbv药物是多年来该领域的研究热点。乙型肝炎病毒(hbv)是有包膜的，部分双链dna病毒。hbv的感染过程包括黏着(识别与结合)、脱壳(释放)，入核(形成rcdna,经修复为cccdna),转录(以cccdna为模板，转录到mrna),翻译(mrna制造病毒蛋白，即包膜蛋白hbsag、核衣壳蛋白hbeag、hbvdna多聚酶等)、逆转录(负链dna,其逆转录正链dna,形成hbvdna)，组装7部分。临床上，高表达hbsag被认为是慢性乙肝感染的显著标志。hbsag的消失，被定义为hbv的“功能性治愈”，随后血清中产生可检测到hbs的抗体被认为是hbv治疗的理想终点。当前疗法所用干扰素和核苷类药物仅能降低hbvdna，而不能有效降低hbsag水平。即使延长治疗时间，核苷类似物所显示的hbsag清除率也与天然观察到的那些相当(在-1％-2％之间)(lancet，2005,365，,13-9；n.engl.j.med.2004,351,1206-17.)。二氢喹嗪酮羧酸类化合物是近年报道的一类对hbv抗原(hbsag)和hbvdna同时具有活性的新型抗hbv化合物，多个跨国制药公司已开展对该类化合物的研究并公开若干专利(wo2017017042a1,wo201815446，wo2018047109,wo2017216685a1,wo2017140821a1)。2017年，瑞士罗氏有限公司(wo2017016960a1)公开了具有以下通式[a]的2-氧代-6，7-二氢苯并[a]喹嗪-3-羧酸类化合物及制备方法,并对通式中的各取代基进行了广泛的定义。通式[a]中的优秀代表物是(s)-6-异丙基-10-甲氧基-9-(3-甲氧基丙基)-2-氧代-6，7-二氢苯并[a]喹嗪-3-羧酸(rg7834)。据报道，rg7834具有明确的体内外抗hbsag和hbeag以及hbvdna活性(j.med.chem.,2018,61,10619-10634)。然而，遗憾的是，可能由于存在毒性问题罗氏有限公司目前已终止了rg7834的i期临床试验(nct02604355)。为了克服上述现有技术所存在的缺陷，本发明人进行了广泛的研究，设计合成了一系列新型的二氢喹嗪酮羧酸类化合物，并测定了它们的体外抗hbv活性及细胞毒性。最终发现，与rg783相比，这类化合物具有更加优越的体外抗hbv(hbsag,hbvdna)活性，而细胞毒性更低。技术实现要素：本发明的目的是提供一类由式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体或非对映异构体，其中：a代表氢或卤素；b代表氢或c1-6烷基；z1和z2可以相同，也可以不同，各自代表ch或n；w代表以下基团：式中：r代表0-3个相同或不同的卤素、c1-3烷基、甲氧基、硝基、氰基、三氟甲基或三氟甲氧基；r1代表甲基，乙基或环丙基；x和y可以相同，也可以不相同，各自代表o或ch2；z3和z4可以相同，也可以不同，各自代表ch或n；n代表0、1或2。优选的，本发明具体包括以下化合物：1)、9-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；2)、9-((7-甲基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；3)、9-((6-甲基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；4)、9-((7-甲氧基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；5)、9-((6-甲氧基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；6)、9-((7-溴-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；7)、9-((6-溴-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；8)、9-((8-氯-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；9)、9-((7-氯-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；10)、9-((6-氯-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；11)、9-((5-氯-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；12)、9-((8-氟-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；13)、9-((7-氟-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；14)、9-((6-氟-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；15)、9-((5-氟-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；16)、9-((7-硝基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；17)、9-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-6-基)甲氧基)-1-氟-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；18)、9-((2，3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-6-基)乙氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6-，7-二氢-2h-吡啶并[2，1-a]异喹啉-3-甲酸；19)、9-((3,4-亚甲二氧基苯基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧基-6,7-二氢-2h-吡啶[2,1-a]异喹啉-3-甲酸；20)、9-((3,4-亚甲二氧基苯基)乙氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧-6,7-二氢-2h-吡啶[2,1-a]异喹啉-3-甲酸；21)、9-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-1-氟-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；22)、9-((8-氟-2,3-二羟基苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-1-氟-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢-2h-吡啶[2,1-a]异喹啉-3-甲酸；23)、9-((8-氯-2-3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-1-氟-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6-，7-二氢-2h-吡啶并[2，1-a]异喹啉-3-甲酸；24)、9-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-2-甲氧基-10-氧代-5,10-二氢-6h-吡啶并[2,1-f][1,6]萘啶-9-甲酸；25)、9-((2，3-二氢[1,4]二噁烷并[2,3-b]吡啶-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6-，7-二氢-2h-吡啶并[2，1-a]异喹啉-3-甲酸；26)、9-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-叔丁基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸；27)、(6s)-9-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸28)、(6s)-9-(((r)-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸29)、(6s)-9-((s)-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸本发明的另一个目的在于提供式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体或非对映异构体的制备方法，其制备方法如反应路线1所示。反应路线1：在反应路线1中，a、b、z1、z2和w如前述的定义。在本发明中用作起始物的式(ⅱ)化合物和式(ⅱ/)化合物为已知化合物,或国内有商品供应或按现有公开的方法可容易地制得(org.lett.2000,2(11),1557-1560)。另一个用作起始物的式(iii)化合物也为已知化合物,参照现有公开的方法可容易地制得(wo2017140821，wo2018047109a1)。式(iv)化合物可这样制备：在非极性溶剂中，使式(ⅱ)化合物与式(iii)化合物发生mitsunobu反应；或在偶极溶剂中加入缚酸剂，将式(ⅱ/)化合物与式(iii)化合物加入到上述溶剂中进行缩合反应。为了提高较贵的起始物式(iiii)化合物的反应效率，使用过量的反应物的式(ⅱ)化合物和式(ⅱ/)化合物，例如对相对起始物为等摩尔到10倍摩尔量，优选等摩尔量到3倍摩尔量。在0℃～100℃，有或无压力条件下搅拌反应2～30小时，来制备式(iv)化合物。用于本反应的非极性溶剂选自四氢呋喃、二氧六环或氯仿；所述的偶极溶剂选自n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜或乙腈；所述的缚酸剂选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾。式(iv)化合物可通过酯的水解反应来制备式(ⅰ)化合物。通常将式(iv)化合物置于质子溶剂中加入无机碱，在室温到50℃，搅拌反应2～10小时来实现。所述的碱选自氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾；所述的质子溶剂选自水、醇或醇-水混合溶剂。本发明的另一个目的在于以式(i)所示化合物或其药用盐为活性成分的药物组合物。本发明的药物组合物中，式(i)所示化合物或其药用盐的重量比为0.1～99.9％，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.1～99.9％。本发明的药物组合物以适合药用的制剂形式存在。本发明的药物组合物可以制备成任何可药用的剂型。优选的，药用的制剂为片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、散剂。本发明的药物组合物，作为制剂形式，每剂中含有的本发明化合物的有效量为0.1～1000mg，所述每剂指的是，每一制剂单位，如片剂的每片，胶囊的每粒，也可指每次服用剂量，如每次服用100mg。本发明的药物组合物可以制备成任何可药用的剂型。优选的，本发明的药用剂型选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、粉针剂、注射剂。在制备成粉剂、片剂、可分散粉剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和软膏形式的固体或半固体药物制剂时，可使用固体载体。可使用的固体载体优选为选自稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、膨胀剂等中的一种或多种物质，或可为包封物质。在粉状制剂中，在载体中含有5～70％的微粒化活性成分。适宜的固体载体包括碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、蔗糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低沸点蜡、可可脂等。由于它们易于给药，片剂，粉剂、扁囊剂和胶囊等代表最有利的口服固体制剂。本发明的液体制剂包括溶液、悬液和乳液。例如，非胃肠道给药的注射制剂可为水或水-丙二醇溶液形式，调节其等渗度，ph等使适于活体的生理条件。液体制剂还可制成在聚乙二醇、水溶液中的溶液形式。可通过将活性成分溶解在水中，再加入适量的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂，来制备口服水溶液。可将微粒化的活性成分分散在粘性物质如天然和合成胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其它已知悬浮剂中制备适于口服的水悬液。为了易于给药及剂量均一，将上述药物制剂配制成剂量单位形式是特别有利的。制剂的剂量单位形式指适于作为单一剂量的物理分离单位，每个单位含有产生所期望的治疗效果的计算好的预定量的活性成分。这种剂量单位形式可为包装形式，如片剂、胶囊或装在小管或小瓶中的粉剂，或装在管或瓶中的软膏、凝胶或霜剂。虽然剂量单位形式中所含活性成分的量可以变化，但一般根据所选择活性成分的效力，调节在1～800mg范围内。本领域技术人员可按常规方法确定适于某种情况的优选剂量。一般，开始治疗的量低于活性成分的最佳剂量，然后逐渐增加给药剂量，直到达到最佳治疗效果。为治疗需要，总的日剂量可一次给药或分数次给药。具体实施方式以下实施例用于进一步解释和说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。下述制备方法中，涉及的起始化合物和中间化合物都属于已知化合物，可以通过现有方法制备得到，或者在市场上购买到。实施例1.9-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸a)2-bromomethyl-1,4-benzodioxane,k2co3,ki,acn,80℃；b)lioh,ch3oh,h2o,rt.步骤a：室温下，向化合物a(45mg，0.16mmol，可参照专利wo2017017042a1方法合成)的乙腈溶液中加入2-溴甲基-1,4-苯并二噁烷(87mg，0.38mmol)，碳酸钾(35mg,0.25mmol)，80℃搅拌过夜，室温冷却，过滤，浓缩。向残余物中加入二氯甲烷稀释，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制备薄层析(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得化合物b(53.6mg，收率84.2％)。步骤b：室温下，向化合物b(50mg,0.09mmol)的甲醇水溶液(5ml,meoh:h2o＝3：2)中加入氢氧化锂(11.8mg,0.49mmol)，同温搅拌2h，1n盐酸水溶液调节ph至1-2，二氯甲烷萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，制备薄层析(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得目标物c(36mg，产率81.3％)；熔点，223-225℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ15.99(s,1h),8.50(s,1h),7.23(s,1h),7.10(s,1h),6.92-6.90(m,4h),6.83(s,1h),4.68(brs,1h),4.45-4.45(d,j＝11.60hz),4.43-4.29(m,3h),3.95(s,3h),3.38-3.34(d,j＝16.26hz,1h),3.09-3.06(d,j＝16.26hz,1h),1.83(brs,1h),0.96-0.95(d,j＝6.72hz,3h),0.85-0.84(d,j＝6.72hz,3h)；13cnmr(400mhz,cdcl3)δ177.95,165.87,150.41,148.59,145.55,145.06,141.63,141.60,124.73,120.89,120.68,118.85,116.37,113.51,112.90,112.54,107.78,70.24,70.14,68.05,66.61,66.40,63.96,63.91(d,j＝7.80hz),55.23,29.31,28.47,28.46(d,j＝1.56hz),18.76,18.57；ms-esi(m/z):478(m+h)+。实施例2.9-((7-甲基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸a)tscl,et3n,dcm；b)5-甲基水杨醛,k2co3,dmf,50℃；c)mcpba,dcm,reflux；d)k2co3,meoh；e)e,ph3p,diad,thf；f)lioh,meoh,h2o.步骤a:室温下，向化合物a(2g,27mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中加入4-甲苯磺酰氯(5.1g,27mmol)，三乙胺(3.6g,35.1mmol)，同温搅拌5h，1n盐酸水溶液洗涤，饱和碳酸钠溶液洗涤，水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得浅黄色油状物b(6.8g)，该粗品直接用于下一步反应。步骤b：室温下，向5-甲基水杨醛(1g,7.35mmol)的n,n-二甲基甲酰胺(10ml)溶液中，加入碳酸钾(1.21g,8.82mmol)，粗品化合物b(2.1g,9.55mmol),于50℃搅拌3.5h，室温冷却，过滤。滤液加水稀释，乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得黄色油状物c(1.8g)，该粗品直接用于下一步反应。步骤c:室温下，向化合物c(1.8g，9.37mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中，加入间氯过氧苯甲酸(2.58g,10.31mmol)，回流5h，室温冷却。向反应液中加入饱和碳酸钠水溶液，10％硫代硫酸钠水溶液淬灭，水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得无色油状物d(1.7g)，该粗品直接用于下一步反应。步骤d:室温下，向化合物d(2.0g，9.56mmol)的甲醇(30ml)溶液中加入碳酸钾(4.4g,31.61mmol)，同温搅拌18h，加水稀释，乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得黄色油状物e(1.2g)，该粗品直接用于下一步反应。步骤e:室温氩气保护下，向化合物f(30mg，0.08mmol)的无水四氢呋喃(5ml)溶液中加入化合物e(28mg，0.16mmol)，三苯基膦(55mg，0.2mmol)，同温搅拌30min，加入偶氮二甲酸二异丙酯(43mg，0.2mmol)，同温搅拌5h，浓缩。残余物经制备薄层析(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得白色固体化合物g(21mg，收率48％)。步骤f:室温下，化合物g(21mg，0.04mmol)得甲醇水溶液中，加入氢氧化锂(6mg，0.25mmol)，同温搅拌2h，反应液加1n盐酸溶液调节ph至1-2，二氯甲烷萃取，二氯甲烷层水洗，饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥，制备薄层析(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得白色固体目标化合物h(17mg，收率85％)；熔点，167-169℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ16.05(d,j＝29.51hz,1h),8.52(s,1h),7.24(s,1h),7.12(s,1h),7.11(s,1h),6.88-6.70(m,3h),4.43-4.37(m,3h),4.02-3.96(m,6h),3.73(d,j＝27.11hz,1h),3.37(d,j＝4.82hz,1h),3.10(d,j＝16.66hz,1h),1.65(m,3h),0.98(s,3h),0.87(s,3h)；ms-esi(m/z):492(m+h)+。实施例3.9-((6-甲基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例2，以4-甲基水杨醛代替5-甲基水杨醛为原料，制得上述目标化合物，收率79％(两步反应)；熔点，207-209℃；1hnmr(500mhz,dmso)δ8.80(s,1h),7.57(s,1h),7.50(s,1h),7.17(s,1h),6.81-6.67(m,3h),4.61(s,1h),4.45-4.43(m,4h),4.17(s,1h),3.91(s,3h),3.32-3.14(m,2h),2.22(s,3h),1.64(s,1h),0.89(s,3h),0.72(s,3h)；ms-esi(m/z):430(m+h)+。实施例4.9-((7-甲氧基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例2，以5-甲氧基水杨醛代替5-甲基水杨醛为原料制得上述目标化合物，白色固体，收率46％(两步反应)；熔点，244-246℃；1hnmr(500mhz,dmso)δ8.80(s,1h),7.57(s,1h),7.50(s,1h),7.18(s,1h),6.84(d,j＝8.35hz,1h),6.53(s,1h),6.46(d,j＝8.35hz,1h),4.65(s,1h),4.46-4.33(m,4h),4.16-4.15(m,1h),3.92(s,3h),3.69(s,3h),3.34-3.14(m,2h),1.64(s,1h),0.89(s,3h),0.72(s,3h)；ms-esi(m/z):508(m+h)+。实施例5.9-((6-甲氧基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例2，以4-甲氧基水杨醛代替5-甲基水杨醛制得上述目标化合物，白色固体，收率66％(两步反应)；熔点，105-107℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ16.11(s,1h),8.53(s,1h),7.41-7.249(m,3h),7.12(s,1h),6.87-6.80(m,1h),6.53-6.48(m,1h),4.76-4.71(d,j＝26.29hz,1h),4.39-4.30(d,j＝44.90hz,2h),4.01-3.97(m,6h),3.78(s,2h),3.39-3.28(m,3h),3.13(d,j＝14.24hz,1h),1.84(brs,1h),0.99(s,3h),0.87(s,3h)；ms-esi(m/z):508(m+h)+。实施例6.9-((7-溴-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例2，以5-溴水杨醛代替5-甲基水杨醛为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率61％(两步反应)；熔点，244-246℃；1hnmr(500mhz,dmso)δ8.80(s,1h),7.57(s,1h),7.50(s,1h),7.16(d,j＝13.55hz,2h),7.03(s,1h),6.91(d,j＝8.62hz,1h),4.70(s,1h),4.46(d,j＝9.56hz,2h),4.32(brs,2h),4.23-4.20(m,1h),3.91(s,3h),3.34-3.30(m,2h),1.62(s,1h),0.73(s,3h),0.72(s,3h)；ms-esi(m/z):556(m+h)+。实施例7.9-((6-溴-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例2，以4-溴水杨醛代替5-甲基水杨醛为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率72％(两步反应)；熔点，231-235℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ16.01(s,1h),8.48(s,1h),7.30(s,2h),7.22(s,1h),7.10(s,1h),6.88(s,1h),6.82(s,1h),6.15(s,1h),4.46-4.28(m,4h),4.02(s,3h),3.90-3.87(m,1h),3.36-3.32(m,1h),3.10(d,j＝16.17hz,1h),1.87-1.84(m,1h),0.98(d,j＝6.49hz,3h),0.86(d,j＝6.55hz,3h)；ms-esi(m/z):556(m+h)+。实施例8.9-((7-氯-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例2，以5-氯水杨醛代替5-甲基水杨醛为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率65％(两步反应)；熔点，221-223℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ16.01(s,1h),8.53(s,1h),7.31(s,1h),7.25(s,1h),7.13-6.85(m,4h),4.69(s,1h),4.46-4.31(m,4h),3.97(s,4h),3.38(d,j＝14.03hz,1h),3.10(d,j＝16.58hz,1h),1.85(s,1h),0.99(d,j＝4.97hz,3h),0.87(d,j＝5.18hz,3h)；ms-esi(m/z):512(m+h)+。实施例9.9-((6-氯-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例2，以4-氯水杨醛代替5-甲基水杨醛为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率72％(两步反应)；熔点，229-231℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ15.86(s,1h),8.38(s,1h),7.15(s,1h),7.09(s,1h),6.97-6.88(m,4h),4.51(s,1h),4.31-4.15(m,4h),3.81(s,4h),3.22(d,j＝15.53hz,1h),2.96(d,j＝16.03hz,1h),1.68(s,1h),0.83(d,j＝5.25hz,3h),0.71(d,j＝5.50hz,3h)；ms-esi(m/z):512(m+h)+。实施例10.9-((8-氯-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例2，以6-氯水杨醛代替5-甲基水杨醛为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率76％(两步反应)；熔点，230-232℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ16.09(s,1h),8.56(s,1h),7.25(s,1h),7.13(s,1h),6.96(s,2h),6.82(s,2h),4.73(s,1h),4.49-4.32(m,4h),3.99-3.95(s,4h),3.38(d,j＝15.82hz,1h),3.10(d,j＝16.51hz,1h),1.83(s,1h),0.96(s,3h),0.83(s,3h)；ms-esi(m/z):512(m+h)+。实施例11.9-((5-氯-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例2，以3-氯水杨醛代替5-甲基水杨醛为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率87％(两步反应)；熔点，292-294℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ16.01(s,1h),8.52(s,1h),7.24(s,1h),7.12(s,1h),7.01(s,1h),6.99-6.84(m,3h),4.71(s,1h),4.57-4.32(m,4h),4.02-3.96(m,4h),3.35(d,j＝15.66hz,1h),3.10(d,j＝16.03hz,1h),1.75(s,1h),0.98-0.97(d,j＝5.55hz,3h),0.86-0.85(d,j＝5.55hz,3h)；ms-esi(m/z):512(m+h)+。实施例12.9-((7-氟-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例2，以3-氯水杨醛代替5-甲基水杨醛为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率58％(两步反应)；熔点，188-190℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ15.98(s,1h),8.52(s,1h),7.32(s,1h),7.26(s,1h),7.13(s,1h),6.90-6.64(m,3h),4.71(s,1h),4.46-4.37(m,3h),4.04-3.94(m,5h),3.39(d,j＝13.14hz,1h),3.12(d,j＝16.27hz,1h),1.87(s,1h),1.00(d,j＝5.88hz,3h),0.89(d,j＝5.37hz,3h)；ms-esi(m/z):496(m+h)+。实施例13.9-((7-硝基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例2，以5-硝基水杨醛代替5-甲基水杨醛为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率43％(两步反应)；熔点，185-187℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ15.90(s,1h),8.49(s,1h),7.87(s,1h),7.30(s,1h),7.25(s,1h),7.11(s,1h),7.04(d,j＝8.32hz,1h),6.86(d,j＝4.08hz,1h),4.72(s,1h),4.61-4.30(m,4h),3.96(s,3h),3.92(s,1h),3.40-3.36(dd,j＝10.96hz,j＝11.35hz,1h),3.10(d,j＝15.96hz,1h),1.84(d,j＝7.36hz,1h),0.99(d,j＝6.53hz,3h),0.88(d,j＝6.72hz,3h)；ms-esi(m/z):523(m+h)+。实施例14.9-((6-氟-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例2，以4-氟水杨醛代替5-甲基水杨醛为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率55％(两步反应)；熔点，222-224℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ16.01(s,1h),8.53(s,1h),7.25(s,1h),7.12(s,1h),6.86(d,2h),6.68(s,1h),6.62(s,1h),4.65(s,1h),4.47-4.31(m,4h),3.97(s,4h),3.38(s,1h),3.12(s,1h),1.84(brs,1h),0.98(s,3h),0.87-0.86(d,j＝4.60hz,3h)；ms-esi(m/z):496(m+h)+。实施例15.9-((8-氟-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施2，以6-氟水杨醛代替5-甲基水杨醛为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率49％(两步反应)；熔点，219-221℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ16.02(s,1h),8.53(s,1h),7.24(s,1h),7.12(s,1h),6.91-.89(d,j＝6.04hz,1h),6.82-6.79(m,1h),6.71-6.72(m,1h),4.72-4.71(m,1h),4.52-4.44(m,2h),4.40-4.32(m,2h),3.96(s,1h),3.39(d,j＝15.38hz,1h),3.10(d,j＝16.25hz,1h),1.85-1.82(m,1h),0.98-0.97(m,3h),0.86-0.84(d,j＝5.71hz,3h)；ms-esi(m/z):496(m+h)+。实施例16.9-((5-氟-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施2，以3-氟水杨醛代替5-甲基水杨醛为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率54％(两步反应)；熔点，281-283℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ16.00(s,1h),8.52(s,1h),7.24(s,1h),7.12(s,1h),6.84(s,1h),6.74(s,1h),4.73(d,j＝4.63hz,1h),4.51(d,j＝11.63hz,1h),4.41-4.33(m,3h),3.96(s,4h),3.39(d,j＝15.86hz,1h),3.11-3.08(d,j＝15.86hz,1h),1.84(brs,1h),0.98(d,j＝6.55hz,3h),0.86(d,j＝6.67hz,3h)；ms-esi(m/z):496(m+h)+。实施例17.9-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-6-基)甲氧基)-1-氟-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例1中步骤，以2-羟基甲基-1,4-苯二恶代替2-噁-7-aza-螺[4.4]壬烷为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率77％(两步反应)；熔点，262-264℃；1hnmr(500mhz,dmso)δ8.79(s,1h),7.55(s,1h),7.48(s,1h),7.20(s,1h),6.99(brs,1h),6.94(s,1h),6.90(d,j＝8.07hz,2h),5.09-5.03(m,2h),4.26(s,4h),3.89(s,3h),3.12(d,j＝16.52hz,1h),2.05-2.02(m,1h),0.98(d,j＝6.40hz,3h),0.73(d,j＝6.57hz,3h)；13cnmr(400mhz,dmso)δ178.75,166.72,151.52,149.00,147.69,147.02,143.81,129.75,127.24,121.83,119.02,117.66,117.44,113.75,113.29,109.84,70.11,64.56,64.52,56.49,31.75,29.53,29.36(d,j＝26.03hz),19.49,19.40；ms-esi(m/z):478(m+h)+。实施例18.9-((2，3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-6-基)乙氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6-，7-二氢-2h-吡啶并[2，1-a]异喹啉-3-甲酸制备方法按照实施例1，以2-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环-6-基)乙醇代替(r)-2-(羟基甲基)-1,4-苯并二噁烷为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率64％(两步反应)；熔点，208-210℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ16.09(s,1h),8.51(s,1h),7.20(s,1h),7.08(s,1h),6.82-6.80(m,2h),6.77-6.75(m,1h),6.71(s,1h),4.25-4.21(m,6h),3.94(s,4h),3.33(d,j＝11.52hz,1h),3.10-3.02(m,3h),1.81-1.79(m,1h),0.93(d,j＝6.69hz,3h),0.82(d,j＝6.83hz,3h)；ms-esi(m/z):492(m+h)+。实施例19.9-((3,4-亚甲二氧基苯基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧基-6,7-二氢-2h-吡啶[2,1-a]异喹啉-3-甲酸制备方法按照实施例1，以胡椒醇代替(r)-2-(羟基甲基)-1,4-苯并二噁烷为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率54％(两步反应)；熔点，210-212℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ16.00(s,1h),8.48(s,1h),7.23(s,1h),7.10(s,1h),6.98(s,1h),6.94(s,1h),6.86(s,1h),6.81(s,1h),5.18-5.12(m,2h),3.98(s,1h),3.88(s,1h),3.36-3.33(m,1h),3.06(d,j＝16.26hz,1h),1.85(m,1h),0.96(d,j＝6.54hz,3h),0.88(d,j＝6.54hz,3h)；ms-esi(m/z):464(m+h)+。实施例20.9-((3,4-亚甲二氧基苯基)乙氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧-6,7-二氢-2h-吡啶[2,1-a]异喹啉-3-甲酸制备方法按照实施例1，以(3,4-亚甲二氧基苯基)乙醇代替(r)-2-(羟基甲基)-1,4-苯并二噁烷为原料，制得上述目标化合物，白色固体，收率63％(两步反应)；熔点，125-127℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ16.04(s,1h),8.47(s,1h),7.20-7.19(m,1h),7.08(s,1h),6.90-6.81(m,h),6.66(s,1h),5.98(d,2h),5.34(s,1h),3.99(s,3h),3.85(s,1h),3.28(d,j＝16.53hz,1h),2.98-2.97(m,1h),1.75(s,4h),0.96-091(m,3h),0.86-0.77(m,3h)；ms-esi(m/z):478(m+h)+。实施例21.9-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-1-氟-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例1，以a(可参照专利wo2017140821合成)和市售可得的b为原料制备目标化合物c,制得上述目标化合物，白色固体，收率45％(两步反应)；熔点，238-240℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ15.10(s,1h),8.45(s,1h),7.67(s,1h),7.00(s,1h),6.3-6.89(m,2h),6.83(s,1h),5.15(s,2h),4.29(s,4h),3.96(s,4h),3.52(s,1h),3.35(s,1h),3.07(d,j＝13.42hz,1h),2.04(s,1h),0.93(d,j＝4.88hz,3h),0.86(d,j＝5.83hz,3h)；ms-esi(m/z):496(m+h)+。实施例22.9-((8-氟-2,3-二羟基苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-1-氟-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢-2h-吡啶[2,1-a]异喹啉-3-甲酸制备方法按照实施例21和实施例2，以6-氟水杨醛为原料可制得目标化合物，制得上述目标化合物，白色固体，收率34％(两步反应)；熔点，102-104℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ15.12(s,1h),8.52(s,1h),7.70(s,1h),6.98(d,j＝8.05hz,1h),6.86(m,1h),6.77(m,2h),4.75-4.74(m,1h),4.00(d,j＝6.63hz,1h),3.96(s,3h),3.42(d,j＝13.97hz,1h),3.15(d,j＝15.55hz,1h),1.80(s,1h),1.00(d,j＝3.53hz,3h),0.89(d,j＝5.15hz,3h)；ms-esi(m/z):514(m+h)+。实施例23.9-((8-氯-2-3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-1-氟-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6-，7-二氢-2h-吡啶并[2，1-a]异喹啉-3-甲酸制备方法按照实施例21和实施例2，以6-氯水杨醛为原料可制得目标化合物，制得上述目标化合物，白色固体，收率53％(两步反应)；熔点，89-91℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ15.07(s,1h),8.48(s,1h),7.68(s,1h),7.00(s,2h),6.86-6.83(m,2h),4.75(d,j＝16.5hz,1h),4.51-4.37(m,4h),3.90(s,4h),3.37(d,j＝15.68hz,1h),3.14(d,j＝16.05hz,1h),2.05-2.04(m,1h),0.98-0.96(m,3h),0.87-0.86(m,3h)；ms-esi(m/z):530(m+h)+。实施例24.9-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-2-甲氧基-10-氧代-5,10-二氢-6h-吡啶并[2,1-f][1,6]萘啶-9-甲酸制备方法按照实施例21，以化合物a(可参照专利方法wo2018047109a1制得)和化合物b(市售可得)为原料可制得目标化合物c，白色固体，收率57％(两步反应)；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ15.07(s,1h),8.48(s,1h),7.68(s,1h),7.02-6.89(m,3h),4.75-4.74(d,1h),4.51-4.37(m,4h),3.90(s,4h),3.39-3.36(d,j＝15.68hz,1h),3.12(d,j＝16.05hz,1h),2.05(d,j＝15.43hz,1h),0.98-0.96(m,3h),0.87-0.86(m,3h)；ms-esi(m/z):479(m+h)+。实施例25.9-((2，3-二氢[1,4]二噁烷并[2,3-b]吡啶-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6-，7-二氢-2h-吡啶并[2，1-a]异喹啉-3-甲酸制备方法按照实施例21，以化合物a(可参照专利方法cn201580003570.9制得)和化合物b(可参照文献方法org.lett.2000,2(11),1557-1560制得)为原料可制得目标化合物c，白色固体，收率39％(两步反应)；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ15.07(s,1h),8.48(s,1h),7.68(s,1h),7.02(s,2h),6.76-6.69(m,2h),4.75-4.74(d,1h),4.51-4.37(m,4h),3.90(s,4h),3.37(d,j＝15.68hz,1h),3.14-3.11(d,j＝16.05hz,1h),2.05-2.04(m,1h),0.98-0.96(m,3h),0.87-0.86(m,3h)；ms-esi(m/z):479(m+h)+。实施例26.9-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-叔丁基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸制备方法按照实施例21，以化合物a(可参照专利方法us2015210682制得)和市售可得的化合物b为原料可制得目标化合物c，白色固体，收率71％(两步反应)，1hnmr(500mhz,cdcl3)δ15.07(s,1h),8.48(s,1h),7.68(s,1h),7.02(s,2h),6.76-6.69(m,2h),4.75-4.74(d,1h),4.51-4.37(m,4h),3.90(s,4h),3.37(d,j＝15.68hz,1h),3.12(d,j＝16.05hz,1h),2.05-2.04(m,1h),0.87(s,9h)；ms-esi(m/z):492(m+h)+。实施例27.(6s)-9-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸a)2-bromomethyl-1,4-benzodioxane,k2co3,ki,acn,80℃；b)lioh,ch3oh,h2o,rt.制备方法参照实施例1，以s构型的化合物a(可参照文献方法制得j.med.chem.,2018,61,10619-10634)为原料可制得目标化合物c,1hnmr(500mhz,cdcl3)δ15.99(s,1h),8.50(s,1h),7.23(s,1h),7.10(s,1h),6.92-6.90(m,4h),6.83(s,1h),4.68(brs,1h),4.45-4.45(d,j＝11.60hz),4.43-4.29(m,3h),3.95(s,3h),3.38-3.34(d,j＝16.26hz,1h),3.09-3.06(d,j＝16.26hz,1h),1.83(brs,1h),0.96-0.95(d,j＝6.72hz,3h),0.85-0.84(d,j＝6.72hz,3h)；ms-esi(m/z):478(m+h)+。实施例28.(6s)-9-(((r)-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸a)(r)-2-bromomethyl-1,4-benzodioxane,k2co3,ki,acn,80℃；b)lioh,ch3oh,h2o,rt.制备方法参照实施例1，以s构型的化合物a(可参照文献方法制得j.med.chem.,2018,61,10619-10634)和r构型的2-溴甲基-苯并二氧六环为原料可制得目标化合物c,1hnmr(500mhz,cdcl3)δ15.99(s,1h),8.50(s,1h),7.23(s,1h),7.10(s,1h),6.92-6.90(m,4h),6.83(s,1h),4.68(brs,1h),4.45-4.45(d,j＝11.60hz),4.43-4.29(m,3h),3.95(s,3h),3.38-3.34(d,j＝16.26hz,1h),3.09-3.06(d,j＝16.26hz,1h),1.83(brs,1h),0.96-0.95(d,j＝6.72hz,3h),0.85-0.84(d,j＝6.72hz,3h)；ms-esi(m/z):478(m+h)+。实施例29.(6s)-9-(((s)-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-2-基)甲氧基)-6-异丙基-10-甲氧基-2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸a)(s)-2-bromomethyl-1,4-benzodioxane,k2co3,ki,acn,80℃；b)lioh,ch3oh,h2o,rt.制备方法参照实施例1，以s构型的化合物a(可参照文献方法制得j.med.chem.,2018,61,10619-10634)和s构型的2-溴甲基-苯并二氧六环为原料可制得目标化合物c,1hnmr(500mhz,cdcl3)δ15.99(s,1h),8.50(s,1h),7.23(s,1h),7.10(s,1h),6.92-6.90(m,4h),6.83(s,1h),4.68(brs,1h),4.45-4.45(d,j＝11.60hz),4.43-4.29(m,3h),3.95(s,3h),3.38-3.34(d,j＝16.26hz,1h),3.09-3.06(d,j＝16.26hz,1h),1.83(brs,1h),0.96-0.95(d,j＝6.72hz,3h),0.85-0.84(d,j＝6.72hz,3h)；ms-esi(m/z):478(m+h)+。生物实施例1体外抗hbsag活性试验从2-8℃冰箱中取出hbsag检测试剂盒(北京科美生物技术有限公司)，在室温下平衡30分钟，同时将浓缩洗涤液作1：20稀释；将微孔板从密封袋中取出，设空白对照两孔，校准品孔，并根据设计的样本数量在板架上放好微孔板条；从-80℃冰箱取出收集6d上清液，除空白对照空外，其余孔分别加入50μl校准品或待测上清；除空白对照孔外，其余每孔加入酶标记物50μl；用微量振荡器振荡混匀5s，用封板膜封闭反应板，置37℃温育1h；每孔应加入350μl的洗涤液，洗板5次，每次浸泡10s，最后在干净的吸水纸上拍干；每孔加入化学发光底物工作液(两种发光底物等体积混匀)100μl，用微量振荡器振荡混匀5s；室温避光静置反应5min，立刻在envision多功能酶标仪上(perkinelmer)依序测量各孔的发光值；根据标准品数值绘制标准曲线，计算每孔hbsag含量。计算hbsag的抑制率。用reed-muench法计算ic50，并与rg7834(消旋体)作对照，结果见表1。生物实施例2体外抗hbv-dna活性及细胞毒性试验1.细胞培养hep2.2.15细胞传代/种板/稀释药物用培养液：含10％胎牛血清(gbico)、380μg/mlg418(gibco)、青霉素和链霉素双抗100u/ml(gibco)的mem(gibco)培养液。hep2.2.15细胞汇合度达90％时，培养瓶内加入0.25％胰酶-edta(gibco)，37℃消化5分钟，弃掉胰酶，残液37℃继续消化5分钟，1:3传代，3-4天传代一次。2.化合物抗hbv药效测定hep2.2.15细胞接种于24孔板中，1×105个/孔，37℃、5％co2中培养；24h后，将孔板中培养基弃去，加入完全培养基稀释的不同浓度药物。设置对照组(培养液不含药)和实验药物组(培养液含有不同浓度药物)。加药第3d更换一次相同培养液，给药6d后观察细胞毒性，然后收取细胞和上清，上清进行2000rpm离心10min后取上清液，保存于-80℃待测。2.1细胞毒性检测给药6d后，在倒置显微镜下观察各孔细胞的生长状态，不同给药浓度的细胞与正常细胞作对比，分别观察各给药孔细胞cpe，以细胞状态改变或死亡比例分别标记为4+(细胞死亡比例75％-100％)、3+(细胞死亡比例50％-75％)、2+(细胞死亡比例25％-50％)、1+(细胞死亡比例0-25％)和0+(细胞状态与对照组无差异)。用reed-muench法计算半数有毒浓度(tc50)，并与rg7834(消旋体)作对照，结果见表1。2.2细胞内hbvcoredna含量测定细胞裂解液配制：10mmtris-hcl/ph＝8.0，1mmedta，1％np40；细胞hbvcoredna提取：每孔加入300ul细胞裂解液，室温裂解5-10min，12000rpm离心5min；取上清，经过蛋白酶k(sigma)作用、苯酚:氯仿:异戊醇抽提、无水乙醇沉淀核酸，最后用用20μl的ddh2o溶解沉淀即得到hbvcoredna，-20℃保存备用。qpcr法对细胞内hbvcoredna测定和计算：使用试剂盒transstarttipgreenqpcrsupermix(北京全式金有限公司)在abi7500fast型高通量实时荧光定量pcr(qpcr)仪检测hbvcoredna含量，每个dna样品重复测定2次。hbvcorednaqpcr引物：5’-ggctttcggaaaattcctatg-3’(上游)；5’-agccctacgaaccactgaac-3’(下游)。反应体系如下所示：real-timepcr反应体系成分加入量hbv上游引物(10μm)0.2μlhbv下游引物(10μm)0.2μl2×sybrgreenreactionmix10μlroxdye0.2μldna1μl去离子水8.4μl共计20μl反应条件：20ul体系，94℃，30s，1个循环；94℃5s，60℃30s，40个循环。每个dna样品平行进行两个反应。反应结束后，每个样品hbvcoredna相对于对照组的含量用δδct法进行计算，计算公式如下：相对含量(％)＝2^(hbvct对照组-hbvct药物组)×100％(hbvct对照组代表病毒对照组hbvcoredna的ct值；hbvct药物组代表不同浓度药物组hbvcoredna的ct值)。然后进行抑制率计算，最后用reed-muench法计算半数抑制浓度(ic50)，并与rg7834(消旋体)作对照，结果见表1。表1.部分实施例化合物的体外活性及细胞毒性nt:未测由表1可见，本申请的式(ⅰ)化合物中的实施例1、3、4、9-13、15-17、20-22、25化合物对hbeag的活性(ic50：0.0002-0.0046μm)大于rg7834(消旋体)(ic50：0.0055μm)，实施例3、4、8、9、11、12化合物对hbv-dna的体外活性(ic50：0.0057-0.0101μm)大于rg7834(消旋体)(ic50：0.0102μm)，细胞毒性(cc50：>100μm)均小于rg7834(消旋体)(cc50：>50μm)。上述表中仅列举本发明部分化合物的体外活性及细胞毒性，本发明其他化合物结构相似，也具有和上述化合物相同或者相近的体外活性而细胞毒性更小，在此不一一列举。组合物实施例实施例1包衣片片芯处方：取上述成分混合均匀，制粒后过筛整粒，干燥、压片制成100片片芯。包衣液处方：欧巴代(opadry)5g，80％乙醇适量包衣。实施例2胶囊处方：制备方法：取处方量原辅料，分别过筛，加入5％聚乙烯吡咯烷酮醇液和吐温80制软材，用20目筛制粒，在室温15℃下晾干，加入十二烷基硫酸钠，混合均匀，按0.27g/s装入0号胃溶胶囊，取样化验，溶出限度为q＝80％，含量应为标示量的90～110％。实施例3颗粒剂取实施例17的化合物100g，加入适量糊精、甜菊素，干式制粒，整粒，分装，即得。实施例4注射剂取实施例19的化合物150g加水溶解，另氯化钠、对羟基苯甲酸乙酯加热水溶解，混匀，调ph值5-7。注射用水稀释至1000ml,用中空纤维膜滤过，灌装，灭菌，即得。实施例5冻干粉针取实施例21的化合物150g加水溶解，另加甘露醇500g加热水溶解，混匀，注射用水稀释至5000ml,用中空纤维膜滤过，灌装，灭菌，冻干即得冻干粉针。实施例6滴丸取实施例21的化合物20g作为原料药备用；称取滴丸基质200g，加热至80℃融化，搅拌均匀；边搅拌边将原料加入辅料基质中，搅拌30min使之均匀，保持药液温度不低于60℃；将配制好的药液注入滴丸机中，滴成滴丸，即可。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 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