一种辅助鉴定小麦苗期根表面积性状的方法及其专用引物组与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种辅助鉴定小麦苗期根表面积性状的方法及其专用引物组。

背景技术：

根系作为植物三大器官之一，是矿物质养分吸收、水分传导的第一部位，对植物生长起固定和支持作用(郭海宇,2013)。第一次绿色革命通过改良作物地上部性状(如矮化育种)、肥水的充分供应提高了籽粒产量，但地下部分的变异并未受到重视，地下根系改良将对提高小麦广适性、肥水利用效率有重要作用(李锦华,2009；gewin,2010；zhao,2011；zhang,2014)。denherder等(2010)指出，持续增加肥水用量来提高小麦产量已难以保障种植收益，目前必须需要改善作物吸收养分和改良作物养分利用能力，提升肥水利用效率，而改善的核心内容是改良根系。对特定环境条件下的小麦根系性状进行遗传解析，挖掘苗期根系生长发育遗传调控机制，可为分子标记辅助筛选、基因工程手段改良根系性状提供科学基础，对于在氮磷减施、干旱等特定气候和土壤环境下培育具有适宜根系构型的小麦新品种具有重要意义。

氮、磷供应量会显著影响小麦根系发育及形态建成。低氮条件下，会导致根系发育严重受阻，干重下降，进而影响养分向地上部运输，使分蘖减少、产量下降。narayanan等(2014)研究表明根干重和根总表面积与茎叶干重显著正相关，根数目和总根长与籽粒产量显著正相关(xie等，2017)。不同土壤环境条件下，理想的根系构型也不尽相同，“深根系”有利于作物适应干旱(ludlowandmuchow,1990；wassonetal.,2012)和低氮环境(garnettetal.,2009)；而“浅根系”有利于作物适应低磷环境(lynch,2011)。

发掘控制根系性状的基因及其基因标记是开展分子标记辅助育种的前提，相对地上部农艺性状，小麦根系性状的遗传解析研究相对滞后。小麦根系发育受多基因控制，目前已报道的小麦根系数量性状(quantitativetraitloci,qtl)位点达300多个，分布在除1d染色体外的各个染色体(christopheretal.,2013；kabiretal.,2015；maccaferrietal.,2016；renetal.,2017)。cao等(2014)通过研究178a(短根系)和178b(长根系)两种不同根系类型小麦品种杂交后代f1、f2的根系，发现qtalro-b1是影响普通小麦根系长度和相关性状的qtl。此外，水稻第9染色体上携带的控制根系深度相关的qtl不仅利于提高植物抗旱性，而且可增强植物对根系营养元素的吸收，该基因的遗传区段rm242-rm201对应的标记已应用于分子辅助育种中，并获得了携带该基因且根系性状优良的株系(steele等,2006)。

中麦895是中国农业科学院作物科学研究所和中国农业科学院棉花研究所联合以周麦16为母本、荔垦4号为父本杂交选育而成的半冬性多穗型中晚熟品种。在2013-2015年品种比较试验和大田示范中表现出高产广适、灌浆后期耐高温等特点。扬麦16是长江中下游麦区种植面积最大的品种，具有灌浆速度快、粒重高等特点。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供检测小麦染色体7bl上snpax95025477位点的基因型的物质的应用。

本发明提供的检测小麦染色体7bl上snpax95025477位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦根系性状中的应用；

所述snpax95025477位点为序列4所示的核苷酸序列第36位。

上述应用中，所述snpax95025477位点的基因型为gg或cc或cg；

或，所述根系性状为根系表面积，在实施例中根系表面积具体指总根表面积。

或，本发明还提供了检测小麦染色体7bl上snpax95025477位点的基因型的物质在选育优良根系性状小麦中的应用。

所述snpax95025477位点为序列4所示的核苷酸序列第36位。

上述应用中，

所述snpax95025477位点的基因型为gg或cc或cg；

或，所述优良根系性状小麦为根系表面积大的小麦，具体为总根表面积大的小麦。

上述应用中，所述检测小麦染色体7bl上snpax95025477位点的基因型的物质为如下1)或2)：

1)为成套引物，所述成套引物为如下a或b:

a所示的成套引物由序列表中序列1所示的单链dna分子、序列表中序列2所示的单链dna分子和序列表中序列3所示的单链dna分子组成；

b所示的成套引物由序列表中序列1第22-39位所示的单链dna分子或其衍生物、序列表中序列2第22-39位所示的单链dna分子或其衍生物和序列表中序列3所示的单链dna分子组成；

2)含有所述成套引物的pcr试剂或试剂盒。

上述应用中，含有所述成套引物的pcr试剂中序列表中序列1所示的单链dna分子或其衍生物、序列表中序列2所示的单链dna分子或其衍生物和序列表中序列3所示的单链dna分子的浓度均为0.25um。

上述序列表中序列1所示的单链dna分子为在序列1第22-39位所示的单链dna分子的5'端连接一种荧光序列(实施例为fam荧光序列f5’-gccggccttccatctactccatga-3’)；

上述序列表中序列2所示的单链dna分子为在序列2第22-39位所示的单链dna分子的5'端连接另一种荧光序列(实施例为hex荧光序列f5’-gccggccttccatctactccatgg-3’)；

或，所述荧光基团序列为荧光序列fam或荧光序列hex。

本发明第2个目的是提供如下方法：

本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定小麦根系性状的方法，包括如下步骤：检测小麦染色体7bl上snpax95025477位点的基因型为gg还是cc还是cg，snpax95025477位点的基因型为cc的待测小麦的根表面积大于snpax95025477位点的基因型为gg或cg的待测小麦。

本发明还提供了一种选育根系表面积大的小麦的方法，为检测小麦染色体7bl上snpax95025477位点的基因型为gg还是cc还是cg，选育snpax95025477位点基因型为cc的待测小麦，得到根系表面积大的小麦；

所述snpax95025477位点为序列4所示的核苷酸序列第36位。

上述方法中，所述检测小麦染色体7bl上snpax95025477位点的基因型为gg还是cc还是cg的方法为如下a)或b)：

a)直接测序；

b)用上述成套引物对待测小麦基因组dna进行pcr扩增产物，对所述pcr扩增产物进行基因分型。

上述方法中，

所述基因分型的方法为采用荧光酶标仪(具体采用pherastar^plus荧光酶标仪)照射后，若所述pcr产物仅显示序列1所示dna分子中5'端连接荧光序列的颜色(fam荧光，蓝色)，则待测小麦染色体7bl上snpax95025477位点的基因型为gg；若所述pcr产物仅显示序列2所示dna分子中5'端连接荧光序列的颜色(hex荧光，红色)，则待测小麦染色体7bl上snpax95025477位点的基因型为cc；

若所述pcr产物显示序列1所示dna分子中5'端连接荧光序列的颜色和序列2所示dna分子中5'端连接荧光序列的颜色(绿色)，则待测小麦染色体7bl上snpax95025477位点的基因型为cg。

本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定小麦根系性状的物质，为上述应用中的所述检测小麦染色体7bl上snpax95025477位点的基因型的物质。

上述中，所述小麦根系性状为小麦苗期根系性状，小麦苗期根系性状具体体现在根表面积，在本发明的实施例是总根表面积。

上述中，所述待测小麦具体为如下品种中的任一种或任几种：阿夫、ca1055、ca1133、轮选987、京冬8号、秦农731、皖麦52、济宁16、济麦21、鲁麦15、洛麦21、绵阳26、宁麦9号、镇麦6号。

本发明的实验证明，本发明发现了一个小麦苗期根系性状相关位点snp位点ax95025477，利用该snp位点可以筛选相关根系性状优良的小麦，在培育水肥高效型小麦品种中发挥重要作用。

附图说明

图1为中麦895(右)和扬麦16(左)的苗期根系图。

图2为一个snp标记与qrosa.caas-7bl基因的连锁图。

图3为供试小麦品种根表面积基因的kasp标记检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所有引物合成均由北京奥科生物技术有限责任公司完成。以下实施例中所有用到的小麦材料均来自中国农业科学院国家农作物种质保存中心。

实施例1、与苗期根系相关基因的snp位点及其标记ax95025477与专用引物的获得

选用扬麦16(中国农业发展集团有限公司，品种权号：cna20030436.4)/中麦895(河南新大农业发展有限公司，国审麦2012010)dh群体，包括亲本共200个家系。

图1为中麦895(右)和扬麦16(左)的苗期根系图。

1、根系性状调查

根部试验采用水培法，即每个品种选取的种子30粒，用10％的处理20-30分钟，无菌水冲洗5-6次。选取h2o2处理过的种子饱满且大小一致置于铺有滤纸的培养皿中，在培养箱暗室催芽。每个材料挑选发芽一致的种子发苗培养，培养盘置于营养液中在可控温室培养，营养液配置参照文献(ren等，2012)。连续培养10天后对苗期根部性状进行调查。调查性状包括最长根长、侧根长、主根长、总根长、侧根表面积、主根表面积、总根表面积、总根尖数和根系干重。

2、引物获得和标记分析

snp(单核苷酸多态性)标记在博奥生物有限公司(capitalbiocorporation,beijing,china；http://bioservices.capitalbio.com)利用illuminasnp基因分型检测，主要分为以下步骤：1)将待测小麦品种基因组dna进行全基因组扩增；2)扩增产物用随机内切酶酶切断化；3)将dna片段与将dna片段与芯片进行杂交，芯片的微珠上连接有50-mers长度特异性捕获探针，gdna酶切后产物与探针互补序列结合；4)清洗去除未杂交上的或错配杂交上的dna片段；5)二硝基酚(dinitrophenol)和生物素(biotin)标记的核苷酸底物(a/t和c/g)在捕获探针上进行单碱基延伸，只有与gdna发生互补结合的探针才能得到延伸；通过染色，a/t和c/g将分别标记不同的荧光染料；6)芯片扫描，并利用软件根据两种荧光判读并输出分型结果。

利用illuminasnp基因分型研究平台对扬麦16/中麦895dh群体进行660ksnp芯片分型，包括bs、bobwhite、cap、d_contig等系列标记，共计630518个，其中626276个snp标记在扬麦16/中麦895dh群体内存在差异。

二、关联基因定位和连锁标记ax95025477的发现

利用sas9.2软件(sasinstitute.2000)进行基本统计量、多重比较分析，并结合sas的glmselect程序对snp数据和根系性状进行逐步回归，根据p值(p<0.01)判断关联位点。定位出ax95025477与位点qrosa.caas-7bl关联(p<0.001)。

三、ax95025477位点的等位基因特异标记鉴定

分别提取16个扬麦16/中麦895dh群体的全基因组dna，以各个基因组dna为模板，用snp位点ax94573388的等位基因特异标记kasp^tm基因分型检测，结果如表1所示，出现c:c分型的片段；表明snp位点ax95025477能够有效鉴定小麦品种根表面积基因。

表1为ax95025477位点等位变异在扬麦16/中麦895dh群体中的分离

结果表明，ax95025477位点的基因型仅为c:c时，与小麦品种具有较大根表面积的表型相符，说明ax95025477位点能够有效鉴定小麦品种根表面积基因及其基因型。ax95025477位点的基因型为c:c的小麦品种根表面积大于ax95025477位点的基因型为c:g或g:g的小麦品种根表面积。

根据wheatdartmapsversion1.2(http://www.triticarte.com.au)和allen等(2011)公布的小麦分子标记图谱，将位点ax95025477整合到小麦遗传图谱上，结果如图2所示，确定qrosa.caas-7bl在染色体7bl上的700.83mb位置。

标记ax95025477所对应的snpax95025477位点为序列4第36位，该核苷酸为c或g；该snp位点的基因型为cc、cg或gg；序列4所示的dna分子位于小麦染色体7bl上的700.83mb位置。

四、kasp标记专用引物的开发

根据snpax95025477位点在小麦染色体7b上的700.83mb位置的核苷酸序列(序列4)，设计测ax95025477位点的引物组如下：

上游引物：f5’-gaaggtgaccaagttcatgctctcgtggtgttcctcgcg-3’(序列1)，

上游引物：f5’–gaaggtcggagtcaacggattctcgtggtgttcctcgcc-3’(序列2)，

下游引物：r5’-ctcagcgagtcgatcttctcc-3’(序列3)。

序列1中，第1-21位为在上游特异引物的5’端添加的特异荧光序列fam：5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’(序列5，荧光照射显示蓝色)，第22-39位为上游特异引物；

序列2中，第1-21位为在上游引物的5’端添加特异荧光序列hex：f5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’(序列6，荧光照射显示红色)，第22-39位为上游特异引物。

上述5’端添加特异荧光序列fam的序列1所示的单链dna分子与序列3所示的单链dna分子扩增snpax95025477位点基因型为g:g的片段(序列7，且第18位为g)，携带fam的序列pcr扩增后的产物经荧光照射显示蓝色；

上述5’端添加特异荧光序列hex的序列2所示的单链dna分子与序列3所示的单链dna分子扩增ax95025477snp位点基因型为c:c的片段(序列7，且第18位为c)，携带hex的序列pcr扩增后的产物经荧光照射显示红色。

上述5’端添加特异荧光序列fam的序列1所示的单链dna分子、5’端添加特异荧光序列hex的序列2所示的单链dna分子和序列3所示的单链dna分子扩增snpax95025477位点基因型为c:g的片段，pcr扩增后的产物经荧光照射照射显示绿色。

五、snpax95025477位点检测小麦根系性状方法的建立

提取待测小麦基因组dna作为模板，用5’端添加特异荧光序列fam的序列1所示引物、5’端添加特异荧光序列hex的序列2所示引物和序列3所示引物进行pcr扩增。

pcr扩增的12μlpcr反应体系包括：5’端添加特异荧光序列fam的序列1所示引物、5’端添加特异荧光序列hex的序列2所示引物和序列3所示引物，且每条引物终浓度为0.25um，终浓度为1mmol·l^-1的tris-hcl(ph9.0)，终浓度为5mmol·l^-1的kcl，终浓度为2.5mmol·l^-1的mgcl2(promega公司)，终浓度为200μmol·l^-1的dntps(takara公司)，taqdna聚合酶1.5u(tiangen公司)，模板dna15ng，其余为水。

pcr扩增反应在ptc-200pcr扩增仪上进行，采用touchdownpcr扩增程序为：

94℃预变性15min；(touchdown程序)94℃变性30s，61℃退火60s，72℃延伸30s，11个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

将得到的pcr扩增产物在pherastar^plus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在klustercaller^tm软件读取分型后的数据。

若pcr扩增产物仅显示蓝色图像(序列1所示dna分子中的5'端连接的荧光颜色)，则待测小麦基因组snpax95025477位点的核苷酸为g，基因型为g:g；若pcr扩增产物仅显示红色图像(序列2所示dna分子中的5'端连接的荧光颜色)，则说明snpax95025477位点核苷酸为c，基因型为c:c；若pcr扩增产物显示绿色图像，则说明snpax95025477位点核苷酸为c/g，基因型为c:g。

结合三的表面积结果可以看出，pcr扩增产物仅为显示红色(snpax95025477位点基因型为c：c)的小麦的根表面积大于pcr扩增产物仅显示蓝色(snpax95025477基因型为g：g)或绿色(snpax95025477位点基因型为c：g)的小麦。

实施例2、snpax95025477位点在检测小麦根系性状中的应用

14个品种中：中麦895和扬麦16为对照组、其他作为检测组：阿夫、ca1055、ca1133、轮选987、京冬8号、秦农731、皖麦52、济宁16、济麦21、鲁麦15、洛麦21、绵阳26、宁麦9号、镇麦6号。

一、常规检测不同待测小麦品种的苗期根系性状

小麦品种苗期根系性状鉴定于2015年冬在中国农业科学院作物科学研究所温室中进行。每个待测小麦品种选取饱满且大小一致的种子30粒，用10％的h2o2处理20-30分钟，无菌水冲洗5-6次；再将种子置于铺有滤纸的培养皿中，在培养箱中暗室催芽18-24h；然后挑选发芽一致的种子25粒置于发苗网上，生长6天后选取大小一致的麦苗10株转移至培养盘中，每个培养盘进行3次重复；再将培养盘置于营养液中在可控温室中进行培养。营养液配置参照文献(reny,hex,liud,lij,zhaox,lib,tongy,zhanga,liz.majorquantitativetraitlociforseminalrootmorphologyofwheatseedlings.molecularbreeding,2012,30:139-148，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得)。幼苗培养条件为温度22±1℃，相对湿度在50％-60％。每3天更换一次营养液，连续培养10天后对苗期根部进行收获。用扫描仪对各品种收获后的根系进行扫描，再用图像分析软件winrhizo(加拿大regentinstruments公司)分析根部性状包括最长根长、侧根长、主根长、总根长、侧根表面积、主根表面积、总根表面积、总根尖数和根系干重，最后统计总根表面积。

二、snpax95025477位点在检测小麦根系性状中的应用

1、提取待测小麦的基因组dna

分别提取各个待测小麦的基因组dna。

2、pcr扩增

以上述基因组dna为模板，用实施例1得到5’端添加特异荧光序列fam的序列1所示引物、5’端添加特异荧光序列hex的序列2所示引物和序列3所示引物进行pcr扩增。

pcr扩增的12μlpcr反应体系包括：5’端添加特异荧光序列fam的序列1所示引物、5’端添加特异荧光序列hex的序列2所示引物和序列3所示引物，且每条引物终浓度为0.25um，终浓度为1mmol·l^-1的tris-hcl(ph9.0)，终浓度为5mmol·l^-1的kcl，终浓度为2.5mmol·l^-1的mgcl2(promega公司)，终浓度为200μmol·l^-1的dntps(takara公司)，taqdna聚合酶1.5u(tiangen公司)，模板dna15ng，其余为水。

pcr扩增反应在ptc-200pcr扩增仪上进行，采用touchdownpcr扩增程序为：

94℃预变性15min；(touchdown程序)94℃变性30s，61℃退火60s，72℃延伸30s，11个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

将得到的pcr扩增产物(序列4)在pherastar^plus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在klustercaller^tm软件读取分型后的数据。

若pcr扩增产物仅显示蓝色图像(序列1所示dna分子中的5'端连接的荧光颜色)，则待测小麦snpax95025477基因型为g:g；若pcr扩增产物仅显示红色图像(序列2所示dna分子中的5'端连接的荧光颜色)，则说明snpax95025477位点基因型为c:c；若pcr扩增产物显示绿色图像，则说明snpax95025477位点基因型为c:g。

pcr扩增产物仅为显示红色(snpax95025477位点基因型为c:c)的小麦根表面积大于pcr扩增产物仅显示蓝色或绿色(snpax95025477位点基因型为g:g或snpax95025477位点基因型为c:g)的小麦。

上述各个小麦的基因型(图3)及其小麦根系性状(根表面积)见表2所示。

表214个小麦品种snp位点基因型和根表面积结果

注：中麦895为cc；扬麦16为gg。

以上结果表明：阿夫、轮选987、京冬8号、鲁麦15、宁麦9号、镇麦6号在snp位点基因型为c:c，并且这些小麦均具有大的根表面积。从上述结果中还可看出，snp位点的基因型为cc的小麦的根表面积要大于基因型为gg的小麦。

上述结果表明，上述snp位点可以快速、准确地鉴定小麦品种是否具有较大的根表面积。

sequencelisting

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种辅助鉴定小麦苗期根表面积性状的方法及其专用引物组

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