一种猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法与流程

本发明属于基因组装及免疫原性鉴定技术领域，尤其涉及一种猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法。

背景技术：

目前，最接近的现有技术：猪细小病毒(porcineparvovirus,ppv)能导致初产母猪及血清学阴性的经产母猪发生流产、不孕、产死胎、木乃伊胎及弱仔等。断奶仔猪多系统衰竭综合征(porcinepostweaingmulisystemicwastingsyndome,pmws)的主要发病原因就是该病与猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2,pcv2)混合感染。ppv感染力强，对外界环境有很强的抵抗力，尤其对ph和温度不敏感。一旦健康猪群感染ppv，三个月内能导致所有猪都感染。而且在发生该病得猪场，生殖失败能持续几年甚至十几年。该病在猪群里的检出率高达85％，对我国养猪业造成巨大的经济损失。

ppv属于细小病毒科，细小病毒属。没有囊膜的病毒粒子呈二十面体对称，直径在20～25nm。基因组是单股负链dna，大小为5000bp左右，负链上没有开放阅读框(orf)，正链有2个orf。5’端编码非结构蛋白ns1、ns2、ns3，其中ns1与基因复制有关，其他两个非结构蛋白功能尚不清楚。3’端编码结构蛋白vp1、vp2、vp3，vp3由vp2水解产生，病毒复制与vp1有关，vp2占整个病毒衣壳的主要地位，拥有4个loop环，抗原位点主要就集中在这几个环上，位于蛋白表面。很多重要的线性表位在vp2上，而本发明利用vp2蛋白能自我组装成没有核酸，不能自我复制的vlps，能同时诱导体液和细胞免疫。

目前预防ppv主要采用疫苗接种，疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗两个主要类别。这些疫苗虽然有效控制了ppv的临床感染，但是灭活疫苗存在灭活不彻底的风险，而弱毒苗有毒力返强的危险。所以，研制安全的新型ppv疫苗对于控制和彻底消灭此病具有重要意义。

综上所述，现有技术存在的问题是：

现有弱毒苗有毒力返强的危险，灭活疫苗存在病毒灭活不彻底，会引起不良反应甚至散毒，成为安全隐患。

解决上述技术问题的难度：

无论弱毒疫苗还是灭活疫苗，都是由完成的病毒粒子组成，存在完成的病毒基因组，都存在不安全性问题，无法从根本上解决这些问题，只能通过提高生物安全防控举措在最大程度内限制不安全事件的发生。这必将提高生产成本，不利于疫苗推广使用和养殖生产。

解决上述技术问题的意义：

基于病毒样颗粒制备的疫苗，不含有病毒基因组，不存在散毒的危险，所以，能够有效简化疫苗的生成过程，降低生产成本，提高疫苗的普及使用，降低疫病的发生，促进生产，保障农业增收。

再有基于ppvvp2的vlps具有很好的包容性，能够容纳外源抗原表位，也是制备嵌合型vlps的理想工具。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法。

本发明是这样实现的，一种猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法，所述猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法包括以下步骤：

步骤一，vp2基因的扩增，优化及重组供体质粒的构建；

步骤二，vp2重组穿梭质粒的构建与鉴定；

步骤三，重组杆状病毒的获得与鉴定；

步骤四，western-blot鉴定vp2蛋白的表达；

步骤五，vp2蛋白的间接免疫荧光鉴定；

步骤六，ppv-av30病毒纯化及鉴定；

步骤七，病毒样颗粒的组装及鉴定。

进一步，步骤一中，所述vp2基因的扩增，优化及重组供体质粒的构建具体包括以下步骤：

(1)根据ppvnadl-2毒株(genbank登录号：kf913351.1)的序列，运用生物信息学软件设计引物，扩增ppv-av30得到vp2基因。

所述上游引物seqidno：1：p1:cgggatccatgagtgaaaatgtggaacaacac；下游引物p2:aactgcagctagtataattttcttgg(下划线分别为保护性碱基和酶切位点：bamhⅰ、pstⅰ)，并根据昆虫细胞嗜性优化合成gs1814op。

(2)设计引物扩增vp2基因，上游引物seqidno：2：p3:cgggatccctggaacgctacactttcaaccc；下游引物p4:aactgcagttagtacagctttctagggatcagctggc(下划线处为保护碱基和酶切位点bamhⅰ、pstⅰ)。

(3)使用通用引物鉴定重组杆粒：seqidno：3：m13f：gtttttcccagtcacgac；seqidno：4：m13r：caggaaacagctatgac，引物均由西安擎科公司合成。

(4)分别以ppv-av30基因组，gs1814op质粒为模板，扩增ppv未优化，优化的vp2基因，回收纯化目的条带。

(5)将目的片段和pfastbac-dual载体分别进行bamhⅰ、pstⅰ双酶切，回收清洁后连接，化学法转dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取未优化、优化后重组供体质粒pfastvp2，并进行酶切、测序鉴定。

进一步，步骤二中，所述vp2重组穿梭质粒的构建与鉴定方法如下：

(1)将未优化、优化pfastvp2供体质粒转化至含有acbacmid和helper质粒的dh10bac感受态细胞，在含有卡那霉素(50g/ml)，庆大霉素(7g/ml)，四环素(10g/ml)，x-gal(100g/ml)和iptg(40g/ml)的lb平板上培养48h，蓝白斑筛选，选取白色菌落。

(2)抽提dna，以m13通用引物进行pcr检测，筛选阳性克隆杆粒，命名为未优化、优化rbacmidvp2，并提取rbacmidvp2重组杆粒，用于细胞转染。

进一步，步骤三中，所述重组杆状病毒的获得与鉴定方法如下：

(1)参照脂质体转染试剂盒cellfectin@iireagent的说明书，将未优化、优化rbacmidvp2转染生长状态良好的sf9昆虫细胞，28℃恒温培养箱培养36～72h，待出现细胞病变后，收集上清作为p1代重组病毒。

(2)将细胞上清在sf9昆虫细胞盲传3代，收集第3代细胞上清，提取病毒dna为模板，以扩增vp2基因的引物p1、p2、p3、p4进行pcr检测，筛选获得阳性重组病毒命名为未优化、优化rbacvp2。

进一步，步骤四中，所述western-blot鉴定vp2蛋白的表达方法如下：

(1)将重组病毒未优化、优化rbacvp2p3代细胞毒接种hf昆虫细胞，感染72h后，离心收集细胞沉淀。

(2)用细胞裂解液pmsf裂解细胞并做超声处理，10000r/min离心10min收集上清，用于western-blot分析。

(3)用5％milk按1:100稀释ppv阳性血清为一抗，以5％milk按1:2000稀释hrp标记的抗猪igg作为二抗，同样的方法处理正常hf昆虫细胞蛋白样品作为阴性对照。

进一步，步骤五中，所述vp2蛋白的间接免疫荧光鉴定方法如下：

(1)将重组病毒未优化、优化rbacvp2p3代细胞毒接种于生长状况良好的hf昆虫细胞，感染12h后，用pbs洗3次。

(2)4℃预冷的4％多聚甲醛室温固定15min后pbs洗3次，0.1％triton-100x通透细胞膜10min后pbs洗3次。

(3)使用5％nbs37℃封闭1h。5％nbs1:100稀释ppv阳性血清为一抗，37℃孵育1h，用pbst洗涤5次。

(4)5％nbs1:300稀释anti-swineigg(h+l)为二抗，37℃孵育1h，用pbst洗涤5次，置于荧光倒置显微镜下观察结果，以同样方法处理hf细胞为阴性对照。

进一步，步骤六中，所述ppv-av30病毒纯化及鉴定方法如下：

(1)将长至细胞瓶底部表面积约70-80％的pk-15细胞从37℃，5％co2培养箱中拿出，弃去旧的培养液。

(2)用pbs漂洗细胞两次，取1.5ml的ppv-av30细胞毒(-40℃保存)直接加入漂洗后的pk-15细胞瓶之中，让细胞与病毒液充分接触，再放入37℃，5％co2培养箱中孵育1h。

(3)孵育1h后，在超净台内加入含10％fbs的dmem完全培养基，当接毒组70％的细胞出现典型病变(大部分细胞出现脱落)时，反复冻融数次即可收毒。

(4)10,000r/min离心30min收集细胞上清，边加边搅拌加入10％peg6000浓缩病毒，10,000r/min离心60min，用pbs重悬沉淀，使用17％蔗糖垫，30,000r/min离心5h粗纯病毒，收集沉淀用pbs溶解后，使用蔗糖密度梯度离心纯化病毒，吸取积份负染制备电镜样观察电镜。

进一步，步骤七中，所述病毒样颗粒的组装及鉴定方法如下：

(1)使用p3代毒株感染hf细胞进行重组蛋白表达，27℃无co2细胞摇床125r/min震荡培养72h。

(2)离心收集细胞，超声破碎得到未优化、优化重组蛋白后，使用蔗糖密度梯度离心纯化后收取积份，经磷钨酸负染色处理，使用透射电镜tem观察病毒样颗粒的组装情况。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明利用昆虫杆状病毒表达系统，一种高效成熟的外源蛋白表达系统，结合ncbi网站对ppv-av30毒株vp2的基因序列分析，构建并表达未优化，优化基因表达蛋白vp2，分析它们之间的差别，并分别分析其反应原性，为新型ppv疫苗的研发和后续以ppv-vlps为载体嵌合其他病毒中和性抗原表位以达到一针两防目的的疫苗奠定基础。

本发明选用真核表达系统-昆虫杆状病毒表达系统bac-to-bac构建含有猪细小病毒毒株av-30未优化、优化后vp2基因的杆状病毒，并感染昆虫细胞表达其结构蛋白vp2。首先，扩增得到猪细小毒株ppv-av30毒株的vp2基因，构建重组供体质粒pfastvp2，转化dh10bac感受态细胞，经蓝白斑筛选和pcr检测，获得重组穿梭载体rbacmindvp2。使用脂质体转染进对数生长期的sf9昆虫细胞，收获重组杆状病毒rbacvp2。经western-blotting检测及间接免疫荧光(ifa)实验分析表明，vp2蛋白在昆虫细胞中正确表达，分子质量约为64kda，并具有良好的反应原性。电镜tem观察，vp2蛋白自组装成vlps，为进一步研制嵌合型vp2病毒样颗粒奠定了基础。

附图说明

图1是本发明实施例提供的猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法流程图。

图2是本发明实施例提供的未优化vp2序列扩增示意图；

图中：m表示dna分子质量标准；1-2表示未优化vp2基因的扩增。

图3是本发明实施例提供的优化vp2序列扩增示意图；

图中：m表示dna分子质量标准；1-2表示未优化vp2基因的扩增。

图4是本发明实施例提供的未优化重组供体质粒的酶切鉴定示意图；

图中：m1、m2是dna分子质量标准；1表示未优化pfastvp2质粒的双酶切产物；2表示未优化pfastvp2质粒。

图5是本发明实施例提供的未优化重组供体质粒的酶切鉴定；

图中：m1、m2是dna分子质量标准；1表示优化pfastvp2质粒的双酶切产物；2表示优化pfastvp2质粒。

图6本发明实施例提供的未优化重组穿梭质粒的pcr鉴定示意图；

图中：m表示dna分子质量标准；1-2表示未优化重组穿梭质粒的pcr。

图7是本发明实施例提供的优化重组穿梭质粒的pcr鉴定；

图中：m表示dna分子质量标准；1-2表示未优化重组穿梭质粒的pcr。

图8是本发明实施例提供的未优化、优化rbacvp2感染sf9细胞产生的cpe情况400×示意图；

图中：a表示未优化rbacvp2感染sf9细胞；b表示优化rbacvp2感染sf9细胞；c表示正常sf9细胞。

图9是本发明实施例提供的vp2蛋白表达的western-bolt检测；

图中：1表示正常hf细胞；2表示未优化rbacvp2感染的hf细胞；3表示优化rbacvp2感染的hf细胞。

图10是本发明实施例提供的ifa检测未优化、优化vp2蛋白在感染细胞中的表达400×示意图；

图中：a表示正常的hf细胞；b表示未优化rbacvp2感染的hf细胞；c表示优化rbacvp2感染的hf细胞。

图11是本发明实施例提供的ppv全病毒粒子(×25.0k)、未优化(×50.0k)、优化vp2(×40.0k)vlps透射电镜观察示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法包括以下步骤：

s101：vp2基因的扩增，优化及重组供体质粒的构建；

s102：vp2重组穿梭质粒的构建与鉴定；

s103：重组杆状病毒的获得与鉴定；

s104：western-blot鉴定vp2蛋白的表达；

s105：vp2蛋白的间接免疫荧光鉴定；

s106：ppv-av30病毒纯化及鉴定；

s107：病毒样颗粒的组装及鉴定。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

1、材料与方法

1.1材料

pfastbacdual载体、ppv-av30毒株、猪细小阳性血清、pk-15细胞和sf9、hf昆虫细胞由本实验室保存，各种限制性内切酶，感受态大肠杆菌dh5a、bl21(de3)均购自takara公司(大连)，昆虫细胞培养基sf-900tmiiisfm(1×)及转染试剂盒cellfectin@iireagent均购自gibco公司，gs1814op优化基因在南京金斯瑞公司合成优化，hrp标记的猪二抗，anti-swineigg(h+l)购自sigma公司。

1.2vp2基因的扩增，优化及重组供体质粒的构建

根据ppvnadl-2毒株(genbank登录号：kf913351.1)的序列，运用生物信息学软件设计引物，扩增ppv-av30得到vp2基因。上游引物seqidno：1：p1:cgggatccatgagtgaaaatgtggaacaacac；下游引物p2:aactgcagctagtataattttcttgg(下划线分别为保护性碱基和酶切位点：bamhⅰ、pstⅰ)，并根据昆虫细胞嗜性优化合成gs1814op。设计引物扩增vp2基因，上游引物seqidno：2：p3:cgggatccctggaacgctacactttcaaccc；下游引物p4:aactgcagttagtacagctttctagggatcagctggc(下划线处为保护碱基和酶切位点bamhⅰ、pstⅰ)。使用通用引物鉴定重组杆粒：seqidno：3：m13f：gtttttcccagtcacgac；seqidno：4：m13r：caggaaacagctatgac，引物均由西安擎科公司合成。分别以ppv-av30基因组，gs1814op质粒为模板，扩增ppv未优化，优化的vp2基因，回收纯化目的条带。将目的片段和pfastbac-dual载体分别进行bamhⅰ、pstⅰ双酶切，回收清洁后连接，化学法转dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取未优化、优化后重组供体质粒pfastvp2，并进行酶切、测序鉴定。

1.3vp2重组穿梭质粒的构建与鉴定

将未优化、优化pfastvp2供体质粒转化至含有acbacmid和helper质粒的dh10bac感受态细胞，在含有卡那霉素(50g/ml)，庆大霉素(7g/ml)，四环素(10g/ml)，x-gal(100g/ml)和iptg(40g/ml)的lb平板上培养48h，蓝白斑筛选，选取白色菌落。抽提dna，以m13通用引物进行pcr检测，筛选阳性克隆杆粒，命名为未优化、优化rbacmidvp2，并提取rbacmidvp2重组杆粒，用于细胞转染。

1.4重组杆状病毒的获得与鉴定

参照脂质体转染试剂盒cellfectin@iireagent的说明书，将未优化、优化rbacmidvp2转染生长状态良好的sf9昆虫细胞，28℃恒温培养箱培养36～72h，待出现细胞病变后，收集上清作为p1代重组病毒。将细胞上清在sf9昆虫细胞盲传3代，收集第3代细胞上清，提取病毒dna为模板，以扩增vp2基因的引物p1、p2、p3、p4进行pcr检测，筛选获得阳性重组病毒命名为未优化、优化rbacvp2。

1.5western-blot鉴定vp2蛋白的表达

将重组病毒未优化、优化rbacvp2p3代细胞毒接种hf昆虫细胞，感染72h后，离心收集细胞沉淀。用细胞裂解液pmsf裂解细胞并做超声处理，10000r/min离心10min收集上清，用于western-blot分析。用5％milk按1:100稀释ppv阳性血清为一抗，以5％milk按1:2000稀释hrp标记的抗猪igg作为二抗，同样的方法处理正常hf昆虫细胞蛋白样品作为阴性对照。

1.6vp2蛋白的间接免疫荧光鉴定

将重组病毒未优化、优化rbacvp2p3代细胞毒接种于生长状况良好的hf昆虫细胞，感染12h后，用pbs洗3次。4℃预冷的4％多聚甲醛室温固定15min后pbs洗3次，0.1％triton-100x通透细胞膜10min后pbs洗3次。使用5％nbs37℃封闭1h。5％nbs1:100稀释ppv阳性血清为一抗，37℃孵育1h，用pbst洗涤5次。5％nbs1:300稀释anti-swineigg(h+l)为二抗，37℃孵育1h，用pbst洗涤5次，置于荧光倒置显微镜下观察结果，以同样方法处理hf细胞为阴性对照。

1.7ppv-av30病毒纯化及鉴定

将长至细胞瓶底部表面积约70-80％的pk-15细胞从37℃，5％co2培养箱中拿出，弃去旧的培养液；用pbs漂洗细胞两次，取1.5ml的ppv-av30细胞毒(-40℃保存)直接加入漂洗后的pk-15细胞瓶之中，让细胞与病毒液充分接触，再放入37℃，5％co2培养箱中孵育1h。孵育1h后，在超净台内加入含10％fbs的dmem完全培养基，当接毒组70％的细胞出现典型病变(大部分细胞出现脱落)时，反复冻融数次即可收毒。10,000r/min离心30min收集细胞上清，边加边搅拌加入10％peg6000浓缩病毒，10,000r/min离心60min，用pbs重悬沉淀，使用17％蔗糖垫，30,000r/min离心5h粗纯病毒，收集沉淀用pbs溶解后，使用蔗糖密度梯度离心纯化病毒，吸取积份负染制备电镜样观察电镜。

1.8病毒样颗粒的组装及鉴定

使用p3代毒株感染hf细胞进行重组蛋白表达，27℃无co2细胞摇床125r/min震荡培养72h。离心收集细胞，超声破碎得到未优化、优化重组蛋白后，使用蔗糖密度梯度离心纯化后收取积份，经磷钨酸负染色处理，使用透射电镜tem观察病毒样颗粒的组装情况。

2、结果

2.1vp2基因的扩增及重组供体质粒pfastvp2的鉴定

以ppv-av30基因组，质粒gs1814op为模板，p1、p2、p3、p4分别为引物扩增未优化、优化vp2基因，获得约为1740bp的目的条带(见图2、图3)，与预计大小相符。筛选获得重组供体质粒pfastvp2，进行bamhi和pstⅰ双酶切验证，结果(见图4、图5)显示，双酶切后有2条特异条带，其中一条为vp2基因约为1740bp，另一条为载体片段约为6000bp，均与预计大小相符。进一步对pfastvp2重组质粒进行测序验证，结果表明插入序列没有碱基突变，完全正确。

2.2重组穿梭质粒及杆状病毒的获得

将未优化、优化pfastvp2重组供体质粒转化dh10bac感受态细胞，筛选白色菌落纯化。提取重组杆粒，经m13引物pcr检测可以扩增到一约4300bp的目的条带，结果见图6、图7。将未优化、优化重组杆粒bacmidvp2脂质体法转染sf9细胞昆虫细胞，28℃培养，第一代没有明显细胞病变，盲传到第3代培养72h后出现明显的细胞病变，主要表现为细胞胀大变圆，细胞核明显，结果见图8。

2.3重组蛋白表达的western-blot鉴定

湿转法对重组蛋白进行western-blot鉴定(见图9)。检测结果显示，重组病毒感染的sf9昆虫细胞样品中，有一约64kda的特异条带，而正常细胞未出现该条带。表明ppv的vp2基因在hf昆虫细胞中成功表达，且表达产物具有一定的反应原性。

2.4重组蛋白表达的间接免疫荧光鉴定

未优化、优化rbacvp2杆状病毒感染hf昆虫细胞，进行免疫荧光检测后，在荧光显微镜下观察结果显示，未优化、优化rbacvp2感染的hf细胞出现红色荧光，而正常的hf细胞未出现荧光，表明ppv的vp2基因在hf昆虫细胞中获得正确表达(见图10)。

2.5重组蛋白及ppv-av30病毒纯化的电镜观察

用透射电镜观察纯化的蛋白及av30病毒粒子，结果显示直径为25nm左右，重组蛋白形态大小均与ppv全病毒粒子相似(见图11)，表明ppv的vp2基因在hf昆虫细胞中成功表达而且成功组装成vlps。

3、结果

病毒样颗粒(vlps)是一种近年来研究很火的安全有效的纳米材料，因为它没有病毒核酸，不能自主复制，没有感染性，但是能同时诱导体液和细胞免疫应答。所以，作为一种新型疫苗研制具有重要的临床应用价值。猪细小病毒ppv高感染率对养猪业具有严重影响，疫苗接种虽然控制了它的流行，但是存在一定的生物安全风险，所以开发新型安全的ppv疫苗势在必行。近年来，大家使用不同表达系统使ppv-vp2蛋白在体外组装形成了vlps，并且针对豚鼠和猪都产生了高特异性抗体水平。

本发明选择了真核表达系统-昆虫杆状病毒表达系统，可以对蛋白进行翻译后加工修饰，少去了原核系统的变性，复性等复杂过程，展示目的蛋白的天然构象。本发明还对目的基因做了未优化和优化两种处理方式，研究发现：昆虫表达系统成功表达了ppv毒株av-30的蛋白vp2，并且正确组装成了vlps，为下一步研究嵌合型vlps奠定了基础。其中，ppv的病毒粒子衣壳是由vp1,vp2,vp3三种蛋白组成，vp2占主要比例，体外组装只需要vp2蛋白就可以形成为vlps。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>58

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

<210>2

<211>68

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

<210>4

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4