一种重组病毒载体、包含其的免疫组合物以及用途的制作方法

本发明属于分子生物学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种重组病毒载体、包含其的免疫组合物以及用途，特别地，本发明涉及一种肿瘤治疗性疫苗。
背景技术：
：随着肿瘤生物学和免疫学的发展，肿瘤免疫治疗取得了长足的进步，逐步成为当前肿瘤治疗的重要发展方向。特别是伴随pd-1/pd-l1免疫疗法的巨大成功，开发肿瘤免疫疗法成为当前肿瘤治疗新兴的热点。肿瘤疫苗通过激发体内的针对肿瘤的特异性免疫应答，活化产生庞大的免疫细胞，来杀伤和控制肿瘤细胞的生长，从而达到减小或控制肿瘤生长的效果。肿瘤疫苗的开发也是当前肿瘤免疫治疗的重点研究方向。研究表明细胞毒(cd8+)和辅助(cd4+)t细胞在肿瘤排斥反应中起了关键的作用。因此，大多数肿瘤疫苗的目标都致力于诱导细胞的特异性的t细胞反应。肿瘤细胞在合成肿瘤抗原的过程中，分解的多肽通过mhci类分子被提呈致肿瘤细胞表面激活cd8+t细胞。mhcii类分子为cd4+t细胞所识别，主要位于特殊的抗原提呈细胞(apc)表面，包括树突状细胞、b细胞和巨噬细胞。肿瘤细胞分泌或肿瘤溶解释放外源性蛋白被apcs俘获。在apc内，抗原被加工成多肽片断并由ii类mhc提呈给cd4+细胞。激活的抗原特异性cd8+细胞最终成为细胞毒t细胞并溶解肿瘤细胞。理想的肿瘤特异性抗原应具有较强的免疫原性，为肿瘤细胞所表达但不表达于正常的细胞。不幸的是，大多数肿瘤抗原都没有足够的免疫原性以诱导有效的免疫反应，而且，许多肿瘤抗原在某种程度上表达于正常的组织，从而导致体内存在免疫耐受。因此，这些肿瘤抗原天然存在免疫原性弱的特点，所设计的肿瘤疫苗就必须要克服机体的免疫耐受障碍，激活针对肿瘤抗原的免疫应答产生。肿瘤疫苗主要分为全细胞疫苗、蛋白疫苗、多肽疫苗、病毒疫苗和树突状细胞疫苗。而dna疫苗和rna疫苗实际上仍属于分子疫苗，只是采用了不同的表达系统。细胞疫苗：过去，对肿瘤抗原与其临床的相关性方面并不十分清楚，因此采用全细胞作为肿瘤疫苗，以便可以提供那些未知的肿瘤抗原来激活免疫系统肿瘤抗原。在小鼠肿瘤模型中，通常使用辐射灭活的肿瘤细胞免疫小鼠，以保护小鼠免受接种的肿瘤的侵袭。但当肿瘤细胞疫苗使用的时间推迟到接种肿瘤细胞后一周时，疫苗就失去了保护小鼠的能力。肿瘤细胞疫苗的临床治疗反应比较差，仅仅适用于无特殊肿瘤抗原的肿瘤病人的预防复发。对于进展期病人在临床研究方面很少获得良好效果。近年来，由于在识别分析肿瘤抗原方面的进展，特别是t细胞识别抗原的机制的深入了解，肿瘤抗原疫苗已基本取代细胞疫苗被用于肿瘤的免疫治疗。多肽和蛋白疫苗：t细胞识别mhc分子表面的抗原多肽表位一般为7-12个氨基酸，因此，抗原多肽可以与免疫佐剂混合应用以达到在体内装载于空虚的mhc分子的目的。到目前为止，几乎所有的以多肽为基础的疫苗都是mhci类抗原限制性多肽。多肽疫苗应用有一些限制。所应用的多肽疫苗必需与病人的mhci类抗原分子相匹配，即所谓的个体化，但由于不同的病人mhci类分子的亚型不同，所使用的肿瘤抗原多肽的序列也不同，因而这给肿瘤抗原多肽的临床应用带来很大的困难。重组分子疫苗：肿瘤抗原蛋白疫苗的应用可以克服这种困难，但是单纯使用蛋白并不能激活机体的免疫反应。灵长类动物试验研究证实最佳的免疫效果需要将肿瘤蛋白与强免疫原性蛋白相绞联。弱抗原要诱导出有效的免疫反应，就必须联合使用免疫佐剂，提供一个非特异性的信号以激活免疫系统，许多免疫佐剂都有一定的毒性而不能应用于临床，所以抗原蛋白疫苗大都是以重组形式出现的。用重组形式增强肿瘤蛋白的免疫原性的方法就是将肿瘤抗原与细胞因子，如gm-csf、白细胞介素等重组形成融合蛋白。肿瘤弱抗原与细菌或病毒抗原、毒素如白喉毒素、假单胞菌毒素等的重组可以明显提高肿瘤抗原的抗原性，促进dc对肿瘤抗原的吞噬提呈，取得了一定的效果。但肿瘤抗原与毒素的单独重组的方法到目前为止仍然还没有达到理想的效果。树突状细胞疫苗：对于有效的t细胞介导的免疫反应，t细胞需要抗原被提呈并致敏初始t细胞，致敏的t淋巴细胞获得再刺激。要启动有效的t细胞介导的肿瘤免疫，来源于体内任何部位的肿瘤抗原多肽必须被t细胞所识别。因此，抗原的提呈是获得有效免疫反应的关键性步骤。疫苗刺激的免疫反应主要依赖于有效的apc对抗原的初加工和进一步的提呈。因此，为了提高肿瘤抗原的免疫原性，激发肿瘤特异性免疫应答，从根本上治愈肿瘤，本领域中需要开发出新的肿瘤疫苗。技术实现要素：本发明的目的是提供一种重组病毒载体，该重组病毒载体可以作为肿瘤疫苗，可以用于预防或治疗多种肿瘤。在本发明的一个实施方案中，所述重组病毒载体包含编码肿瘤抗原的多核苷酸。为了本发明的目的以下定义下列术语。“肿瘤抗原”是指在肿瘤发生、发展过程中新出现或过度表达的抗原物质。肿瘤抗原包括但不限于肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、组织分化抗原、原癌病毒抗原和肿瘤-睾丸抗原(cancer-testisantigens，ct抗原)等。“肿瘤特异性抗原”(tumor-specificantigens，tsa)是指仅在肿瘤细胞中表达，不在正常细胞中表达的抗原物质。例如突变的抗原，特别是原癌基因和肿瘤抑制基因的突变产物，包括ras和p53等。“肿瘤相关抗原”(tumor-associatedantigens，taa)是指在肿瘤细胞中和一些正常细胞中表达的抗原物质。肿瘤-睾丸抗原是指只在肿瘤细胞和一些生殖细胞中表达的抗原物质。例如ny-eso-1、lage-1和mage-a3等。在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤抗原选自肺癌抗原、睾丸癌抗原、黑色素瘤抗原、肝癌抗原、乳腺癌抗原或前列腺癌抗原中的一种或多种。在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤抗原包括但不限于甲胎蛋白(alphafetoprotein，afp)、癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，cea)、粘蛋白1(mucins，muc1)、黑色素瘤相关抗原(melanoma-associatedantigen，mage)、ny-eso-1、lage-1、p53和ras等。在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤抗原选自lage抗原、mage抗原或ny-eso-1抗原中的一种或多种。优选地，lage抗原为lage-1抗原，mage抗原为mage-a3抗原。进一步优选地，所述肿瘤抗原包含lage-1抗原、mage-a3抗原和ny-eso-1抗原。优选地，所述lage-1抗原的氨基酸序列如seqidno:1所示，其编码核酸序列如seqidno:2所示。优选地，所述mage-a3抗原的氨基酸序列如seqidno:3所示，其编码核酸序列如seqidno:4所示。优选地，所述ny-eso-1抗原的氨基酸序列如seqidno:5所示，其编码核酸序列如seqidno:6所示。优选地，所述肿瘤抗原还包含霍乱毒素b亚单位多肽，优选地，所述霍乱毒素b亚单位多肽的氨基酸序列如seqidno:7所示，其编码核酸序列如seqidno:8所示。优选地，包含lage-1抗原、mage-a3抗原和ny-eso-1抗原的肿瘤抗原的氨基酸序列如seqidno:9所示，其编码核酸序列如seqidno:10所示。优选地，重组病毒是痘苗病毒，优选为复制型痘苗病毒载体，例如痘苗病毒天坛株，例如752-1株，或者为非复制型痘苗病毒载体，例如痘苗病毒减毒疫苗安卡拉株(modifiedvacciniaankara，mva)。本发明的另一目的是提供一种免疫组合物，所述免疫组合物包含治疗有效量的根据本发明的重组病毒载体，以及药学上可接受的载体。本发明的另一目的是提供一种肿瘤疫苗，所述肿瘤疫苗包含治疗有效量的根据本发明的重组病毒载体，以及药学上可接受的载体。本发明的另一目的是提供一种药盒，所述药盒包含根据本发明的重组病毒载体和/或免疫组合物和/或肿瘤疫苗，以及其使用说明。本发明还提供了根据本发明的重组病毒载体、免疫组合物和/或肿瘤疫苗在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。优选地，所述肿瘤为恶性肿瘤。优选地，所述恶性肿瘤为乳腺癌或结肠癌。本发明还提供了一种用于治疗或预防肿瘤的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的根据本发明的重组病毒载体、免疫组合物和/或肿瘤疫苗；优选地，所述肿瘤为恶性肿瘤；更优选地，所述恶性肿瘤为乳腺癌或结肠癌。本发明提供的重组病毒载体能够激发肿瘤特异性免疫应答，有效抑制肿瘤细胞生长，延长肿瘤患者的生存时间。附图说明图1和图2分别是带有lage-1、mage-a3和ny-eso-1抗原编码序列的穿梭载体载体psc65-lmnb的质粒图谱和双酶切鉴定图。图3为实施例4中的4t1-hny-eso-1小鼠肿瘤模型，各组小鼠肿瘤生长情况。图4为实施例4中的4t1-hny-eso-1小鼠肿瘤模型，各组小鼠总体存活状况。图5为实施例5中的ct26-mage-a3小鼠肿瘤模型，各组小鼠肿瘤生长情况。图6为实施例5中的ct26-mage-a3小鼠肿瘤模型，各组小鼠总体存活状况。图7为实施例6中的ct26-lage-1小鼠肿瘤模型，各组小鼠肿瘤生长情况。图8为实施例6中的ct26-lage-1小鼠肿瘤模型，各组小鼠总体存活状况。图9为实施例7中的ct26-lage-1小鼠肿瘤模型，各组小鼠总体存活状况。图10为实施例8中的4t1-ny-eso-1小鼠肿瘤模型，各组小鼠总体存活状况。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。实施例1穿梭载体psc65-lmnb构建表达三联融合肿瘤抗原lage-1、mage-a3、ny-eso-1以及霍乱毒素b亚单位的真核表达载体pvkd1.0-lmnb由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供(参考cn109575142a)，其中，所述lage-1抗原的氨基酸序列如seqidno:1所示，其编码核酸序列如seqidno:2所示；所述mage-a3抗原的氨基酸序列如seqidno:3所示，其编码核酸序列如seqidno:4所示；所述ny-eso-1抗原的氨基酸序列如seqidno:5所示，其编码核酸序列如seqidno:6所示；所述霍乱毒素b亚单位多肽的氨基酸序列如seqidno:7所示，其编码核酸序列如seqidno:8所示；lmnb融合蛋白氨基酸如seqidno:9所示，其核酸编码序列如seqidno:10所示。用sali和kpni从pvkd1.0-lmnb切下含有lmnb片段，然后转移至穿梭载体psc65(addgene，货号：30327)上的多克隆位点sali与kpni之间，构建成可表达融合蛋白抗原的穿梭载体psc65-lmnb(质粒图谱如图1)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶sali与kpni鉴定载体psc65-lmnb(酶切体系如表1)，其酶切验证图谱如图2所示。表1质粒psc65-lmnb的酶切鉴定体系(37℃酶切2小时)酶切体系体积质粒psc65-lmnb3μl，约1μgsali(宝生物，货号1080a)1μlkpni(宝生物，货号1068a)1μl酶切缓冲液1μlddh2o补至10μl实施例2重组痘苗病毒载体rvv-lmnb构建在143b细胞中获得重组痘苗病毒载体，具体方法如下。第1天，在6孔细胞培养板(jet，tcp-010-006)铺143b细胞(crl-8303)，1×106/孔，于37℃二氧化碳细胞培养箱中过夜孵育。第二天，以0.05moi(即5×104pfu(空斑形成单位)/孔)加入痘苗病毒野生株752-1(由北京生物制品所提供)，然后置于37℃二氧化碳细胞培养箱中孵育两个小时，期间准备穿梭载体/转染试剂复合物。其中穿梭载体为实施例1中获得的psc65-lmnb，转染试剂为turbofect(thermofisherscientific，r0531)，转染剂量与复合方法可参见转染试剂说明书。复合体系完成后，将143b细胞上清换为2ml/孔的含2％胎牛血清(fbs)的dmem维持培养基，然后加入穿梭载体/转染试剂复合物。转染48小时后，去上清，收集细胞，并在0.5ml维持培养基中重悬，反复冻融三次，然后将重组细胞裂解物接入新的143b细胞上(含50μg/mlbrdu)，37℃孵育1到2天。期间观察细胞病变，待病毒噬斑出现合适数量时(低于20空斑/孔)，进行单斑纯化。单斑纯化将2％低熔点琼脂糖微波炉加热(中高火2分钟左右)至沸，转移至45℃水浴降温并防止其凝固。吸取适量2×维持培养液(1ml/孔)，按体积比1:50加入x-gal储存液，在45℃水浴中预热。按等体积比例混合低熔点琼脂糖与含x-gal的2×维持培养液，制成铺斑固体培养基，去细胞上清，小心加入铺斑固体培养基，然后转移至4℃冰箱凝固10分钟，期间不要动6孔板，防止凝固不均匀。待完全凝固后，转移6孔板至37℃细胞培养箱中孵育2至4小时(有时过夜)，直至蓝斑出现。待蓝斑出现后，用1ml枪头(预先用剪刀将枪头剪平)优先挑取分散较好的，颜色较深的蓝斑，挑取时一定要将固体培养基下面的细胞层挑到，每孔挑取若干个蓝斑，分别转移至含0.5ml维持培养液的ep管中。振荡混匀含病毒的ep管，反复冻融三次(-80℃冰箱约5分钟，室温约2分钟)，最后振荡混匀，-80℃冻存。重复六轮单斑纯化，直至纯度至100％。实施例3重组痘苗病毒载体rvv-lmnb扩增制备与滴定将实施例2中构建的重组痘苗病毒载体rvv-lmnb，以及痘苗病毒野生株分别在vero细胞(ccl-81)上扩增，扩增方法如下。前一天，准备汇集度100％的vero单层细胞(1×107细胞/皿)，共10皿。去上清，换为维持培养基，将待扩增的痘病毒接种到细胞上(0.01pfu/细胞)，37℃培养箱孵育2-3天，观察可见明显的细胞病变。将细胞刮下并收集，1800g离心5分钟，去上清。用5ml维持培养基进行重悬，在冰上用超声波细胞粉粹机超声，超声条件为：50瓦，5秒超声/5秒间隔，共15分钟。反复冻融两次(-80℃冰箱约5分钟，室温约2分钟)，最后振荡混匀；在二级生物安全柜中进行分装至1.5ml离心管中，1ml/支，-80℃冻存。扩增制备好的痘苗病毒在vero细胞上进行感染效价滴定，具体方法如下。前一天，在24孔板中，准备汇集度100％的vero细胞，3×105/孔。去上清，每孔添加200μl维持培养液，以防止细胞干涸。取100μl待测痘病毒加入900μl维持培养基，十倍稀释，连续稀释101，102，103，直到109倍。注意：进行稀释时，因为由高浓度向低浓度稀释，每次向低浓度稀释应更换枪头。从病毒浓度由小到大(109，108，……104)添加到24孔板中，每孔400μl稀释液，两个重复，连续测定6个稀释倍数。将添加完的24孔板放入37℃细胞培养箱中孵育2天。显微镜下数出病毒蚀斑的数目，多于20的，记为20+。将可以数出的20(含)以内的蚀斑数目两复孔求平均×2.5(1000μl/400μl)×相应孔的稀释倍数，即为重组病毒滴度(pfu/ml)。痘苗病毒载体效价滴定结果如表2所示。表2痘苗病毒载体效价滴定痘苗病毒效价(pfu/ml)痘苗病毒野生型rvv-wt1.5×108重组痘苗病毒rvv-lmnb1.0×108实施例4肿瘤治疗实验1从苏州大学动物实验中心购买20只6-8周龄的雌性balb/c小鼠，并饲养于苏州大学动物实验中心spf级动物房中。在第0天，所有小鼠皮下接种表达ny-eso-1肿瘤抗原的肿瘤细胞4t1-hny-eso-1稳定转染细胞系(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，接种剂量为2×105细胞/只，然后随机分成2两组。在肿瘤细胞接种后第1天，第14天和第28天给相应小鼠小腿胫骨前肌接种实施例3中制备的痘苗病毒载体(具体疫苗接种规划如表3)。接种后连续观察并测量肿瘤生长情况。按照以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长×宽2/2。当小鼠肿瘤体积超过2000mm3时，对小鼠处死。表3实验动物分组与疫苗接种规划各组免疫小鼠肿瘤生长情况如图3所示。其中，对照组小鼠在攻瘤后(即肿瘤接种后)第12天全部出现肿瘤，并迅速生长。与未治疗的对照组相比，rvv-lmnb治疗组小鼠肿瘤生长较慢。而且，在小鼠攻瘤后第21天，治疗组小鼠肿瘤平均大小显著小于对照组。结果表明痘苗病毒载体疫苗rvv-lmnb能抑制带有ny-eso-1表达的肿瘤生长。小鼠存活状况的生存曲线结果如图4所示，痘苗病毒载体疫苗rvv-lmnb治疗组小鼠总体生存(os中位数40天)优于对照组小鼠(os中位数36天，p<0.05)。结果表明痘苗病毒载体疫苗rvv-lmnb能提高患有表达ny-eso-1肿瘤的小鼠生存。实施例5肿瘤治疗实验2从苏州大学动物实验中心购买20只6-8周龄的雌性balb/c小鼠，并饲养于苏州大学动物实验中心spf级动物房中。在第0天，所有小鼠皮下接种表达mage-a3肿瘤抗原的肿瘤细胞ct26-mage-a3稳定转染细胞系(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，接种剂量为2×105细胞/只，然后随机分成2两组。在肿瘤细胞接种后第1天，第14天和第28天给相应小鼠小腿胫骨前肌接种实施例3中制备的痘苗病毒载体(具体疫苗接种规划如表4)。接种后连续观察并测量肿瘤生长情况。按照以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长×宽2/2。当小鼠肿瘤体积超过10000mm3时，对小鼠处死。表4实验动物分组与疫苗接种规划各组免疫小鼠肿瘤生长情况如图5所示。其中，对照组小鼠在肿瘤接种后第15天全部出现肿瘤，并迅速生长。在小鼠攻瘤后第30天，治疗组小鼠肿瘤平均大小显著小于对照组。结果表明痘苗病毒载体疫苗rvv-lmnb能抑制带有mage-a3表达的肿瘤生长。小鼠存活状况的生存曲线结果如图6所示，痘苗病毒载体疫苗rvv-lmnb治疗组小鼠总体生存(os中位数40天)优于对照组小鼠(os中位数33天，p<0.05)。结果表明痘苗病毒载体疫苗rvv-lmnb能提高患有表达mage-a3肿瘤的小鼠生存。实施例6肿瘤治疗实验3从苏州大学动物实验中心购买20只6-8周龄的雌性balb/c小鼠，并饲养于苏州大学动物实验中心spf级动物房中。在第0天，所有小鼠皮下接种表达lage-1肿瘤抗原的肿瘤细胞ct26-lage-1稳定转染细胞系(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，接种剂量为1×105细胞/只，然后随机分成2两组。在肿瘤细胞接种后第1天，第14天和第28天给相应小鼠小腿胫骨前肌接种实施例3中制备的痘苗病毒载体(具体疫苗接种规划如表5)。接种后连续观察并测量肿瘤生长情况。按照以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长×宽2/2。当小鼠肿瘤体积超过10000mm3时，对小鼠处死。表5实验动物分组与疫苗接种规划各组免疫小鼠肿瘤生长情况如图7所示。在攻瘤后第26天，对照组小鼠肿瘤生长迅速，并显著大于治疗组小鼠，一直持续到第50天。结果表明痘苗病毒载体疫苗rvv-lmnb能抑制带有lage-1表达的肿瘤生长。小鼠存活状况的生存曲线结果如图8所示，痘苗病毒载体疫苗rvv-lmnb治疗组小鼠总体生存(os中位数58天)优于对照组小鼠(os中位数51天，p<0.05)。结果表明痘苗病毒载体疫苗rvv-lmnb能提高患有表达lage-1肿瘤的小鼠生存。实施例7肿瘤治疗实验4从苏州大学动物实验中心购买20只6-8周龄的雌性balb/c小鼠，并饲养于苏州大学动物实验中心spf级动物房中。在第0天，所有小鼠皮下接种表达lage-1肿瘤抗原的肿瘤细胞ct26-lage-1稳定转染细胞系(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，接种剂量为1×105细胞/只，然后随机分成2两组。在肿瘤细胞接种后第1天，第14天和第28天，给蛋白组小鼠蛋白疫苗lmnb(具体制备方式和接种方式如中国发明专利申请cn109575141a的实施例8和实施例9中所述)接种，蛋白疫苗均在与完全弗氏佐剂(cfa)或不完全弗氏佐剂(ifa)充分乳化后，背部皮下注射，10μg/只。相应地，在肿瘤细胞接种后第1天，第14天和第28天，痘苗组小鼠小腿胫骨前肌接种实施例3中制备的痘苗病毒载体(具体疫苗接种规划如表6)。接种后连续观察并测量肿瘤生长情况。按照以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长×宽2/2。当小鼠肿瘤体积超过10000mm3时，对小鼠处死。表6实验动物分组与疫苗接种规划小鼠存活状况的生存曲线结果如图9所示，痘苗病毒载体疫苗rvv-lmnb治疗组小鼠总体生存(os中位数58天)优于蛋白组小鼠(os中位数51天，p<0.05)。结果表明痘苗病毒载体疫苗rvv-lmnb能提高患有表达lage-1肿瘤的小鼠生存。实施例8肿瘤治疗实验5从苏州大学动物实验中心购买20只6-8周龄的雌性balb/c小鼠，并饲养于苏州大学动物实验中心spf级动物房中。在第0天，所有小鼠皮下接种表达ny-eso-1肿瘤抗原的肿瘤细胞4t1-hny-eso-1稳定转染细胞系(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，接种剂量为2×105细胞/只，然后随机分成2两组。在肿瘤细胞接种后第1天，第14天和第28天，给蛋白组小鼠蛋白疫苗lmnb(具体制备方式和接种方式如中国发明专利申请cn109575141a的实施例8和实施例9中所述)接种，蛋白疫苗均在与完全弗氏佐剂(cfa)或不完全弗氏佐剂(ifa)充分乳化后，背部皮下注射，10μg/只。相应地，在肿瘤细胞接种后第1天，第14天和第28天，痘苗组小鼠小腿胫骨前肌接种实施例3中制备的痘苗病毒载体(具体疫苗接种规划如表7)。接种后连续观察并测量肿瘤生长情况。按照以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长×宽2/2。当小鼠肿瘤体积超过2000mm3时，对小鼠处死。表7实验动物分组与疫苗接种规划小鼠存活状况的生存曲线结果如图10所示，痘苗病毒载体疫苗rvv-lmnb治疗组小鼠总体生存(os中位数40天)优于对照组小鼠(os中位数36天，p<0.05)。结果表明痘苗病毒载体疫苗rvv-lmnb能提高患有表达ny-eso-1肿瘤的小鼠生存。尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。序列表<110>苏州工业园区唯可达生物科技有限公司<120>一种重组病毒载体、包含其的免疫组合物以及用途<130>dic19110064<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>210<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metglnalagluglyargglythrglyglyserthrglyaspalaasp151015glyproglyglyproglyileproaspglyproglyglyasnalagly202530glyproglyglualaglyalathrglyglyargglyproargglyala354045glyalaalaargalaserglyproargglyglyalaproargglypro505560hisglyglyalaalaseralaglnaspglyargcysprocysglyala65707580argargproaspserargleuleugluleuhisilethrmetprophe859095serserprometglualagluleuvalargargileleuserargasp100105110alaalaproleuproargproglyalavalleulysaspphethrval115120125serglyasnleuleuphemetservalargaspglnaspargglugly130135140alaglyargmetargvalvalglytrpglyleuglyseralaserpro145150155160gluglyglnlysalaargaspleuargthrprolyshislysvalser165170175gluglnargproglythrproglyproproproprogluglyalagln180185190glyaspglycysargglyvalalapheasnvalmetpheseralapro195200205hisile210<210>2<211>630<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atgcaggccgaaggccggggcacagggggttcgacgggcgatgctgatggcccaggaggc60cctggcattcctgatggcccagggggcaatgctggcggcccaggagaggcgggtgccacg120ggcggcagaggtccccggggcgcaggggcagcaagggcctcggggccgagaggaggcgcc180ccgcggggtccgcatggcggtgccgcttctgcgcaggatggaaggtgcccctgcggggcc240aggaggccggacagccgcctgcttgagttgcacatcacgatgcctttctcgtcgccaatg300gaagcggagctggtccgcagaatcctgtcccgggatgccgcaccgctcccccgaccaggg360gcggttctgaaggacttcaccgtgtccggcaacctactgtttatgtcagttcgggaccag420gacagggaaggcgctgggcggatgagggtggtgggttgggggctgggatcagcctccccg480gaggggcagaaagctagagatctcagaacacccaaacacaaggtctcagaacagagacct540ggtacaccaggcccgccgccacccgagggagcccagggagatgggtgcagaggtgtcgcc600tttaatgtgatgttctctgcccctcacatt630<210>3<211>313<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3proleugluglnargserglnhiscyslysproglugluglyleuglu151015alaargglyglualaleuglyleuvalglyalaglnalaproalathr202530glugluglnglualaalaserserserserthrleuvalgluvalthr354045leuglygluvalproalaalagluserproaspproproglnserpro505560glnglyalaserserleuprothrthrmetasntyrproleutrpser65707580glnsertyrgluaspserserasnglngluglugluglyproserthr859095pheproaspleugluserglupheglnalaalaleuserarglysval100105110alagluleuvalhispheleuleuleulystyrargalaargglupro115120125valthrlysalaglumetleuglyservalvalglyasntrpglntyr130135140phepheprovalilepheserlysalaserserserleuglnleuval145150155160pheglyilegluleumetgluvalaspproileglyhisleutyrile165170175phealathrcysleuglyleusertyraspglyleuleuglyaspasn180185190glnilemetprolysalaglyleuleuileilevalleualaileile195200205alaarggluglyaspcysalaprogluglulysiletrpglugluleu210215220servalleugluvalphegluglyarggluaspserileleuglyasp225230235240prolyslysleuleuthrglnhisphevalglngluasntyrleuglu245250255tyrargglnvalproglyseraspproalacystyrglupheleutrp260265270glyproargalaleuvalgluthrsertyrvallysvalleuhishis275280285metvallysileserglyglyprohisilesertyrproproleuhis290295300glutrpvalleuarggluglygluglu305310<210>4<211>939<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cccctggagcagcgcagccagcactgcaagcccgaggagggcctggaggcccgcggcgag60gccctgggcctggtgggcgcccaggcccccgccaccgaggagcaggaggccgccagcagc120agcagcaccctggtggaggtgaccctgggcgaggtgcccgccgccgagagccccgacccc180ccccagagcccccagggcgccagcagcctgcccaccaccatgaactaccccctgtggagc240cagagctacgaggacagcagcaaccaggaggaggagggccccagcaccttccccgacctg300gagagcgagttccaggccgccctgagccgcaaggtggccgagctggtgcacttcctgctg360ctgaagtaccgcgcccgcgagcccgtgaccaaggccgagatgctgggcagcgtggtgggc420aactggcagtacttcttccccgtgatcttcagcaaggccagcagcagcctgcagctggtg480ttcggcatcgagctgatggaggtggaccccatcggccacctgtacatcttcgccacctgc540ctgggcctgagctacgacggcctgctgggcgacaaccagatcatgcccaaggccggcctg600ctgatcatcgtgctggccatcatcgcccgcgagggcgactgcgcccccgaggagaagatc660tgggaggagctgagcgtgctggaggtgttcgagggccgcgaggacagcatcctgggcgac720cccaagaagctgctgacccagcacttcgtgcaggagaactacctggagtaccgccaggtg780cccggcagcgaccccgcctgctacgagttcctgtggggcccccgcgccctggtggagacc840agctacgtgaaggtgctgcaccacatggtgaagatcagcggcggcccccacatcagctac900ccccccctgcacgagtgggtgctgcgcgagggcgaggag939<210>5<211>179<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5glnalagluglyargglythrglyglyserthrglyaspalaaspgly151015proglyglyproglyileproaspglyproglyglyasnalaglygly202530proglyglualaglyalathrglyglyargglyproargglyalagly354045alaalaargalaserglyproglyglyglyalaproargglyprohis505560glyglyalaalaserglyleuasnglycyscysargcysglyalaarg65707580glyprogluserargleuleugluphetyrleualametpropheala859095thrprometglualagluleualaargargserleualaglnaspala100105110proproleuprovalproglyvalleuleulysgluphethrvalser115120125glyasnileleuthrileargleuthralaalaasphisargglnleu130135140glnleuserilesersercysleuglnglnleuserleuleumettrp145150155160ilethrglncyspheleuprovalpheleualaglnproprosergly165170175glnargarg<210>6<211>537<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6caggccgaaggccggggcacagggggttcgacgggcgatgctgatggcccaggaggccct60ggcattcctgatggcccagggggcaatgctggcggcccaggagaggcgggtgccacgggc120ggcagaggtccccggggcgcaggggcagcaagggcctcggggccgggaggaggcgccccg180cggggtccgcatggcggcgcggcttcagggctgaatggatgctgcagatgcggggccagg240gggccggagagccgcctgcttgagttctacctcgccatgcctttcgcgacacccatggaa300gcagagctggcccgcaggagcctggcccaggatgccccaccgcttcccgtgccaggggtg360cttctgaaggagttcactgtgtccggcaacatactgactatccgactgactgctgcagac420caccgccaactgcagctctccatcagctcctgtctccagcagctttccctgttgatgtgg480atcacgcagtgctttctgcccgtgtttttggctcagcctccctcagggcagaggcgc537<210>7<211>123<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ilelysleulyspheglyvalphephethrvalleuleuserserala151015tyralahisglythrproglnasnilethraspleucysalaglutyr202530hisasnthrglniletyrthrleuasnasplysilephesertyrthr354045gluserleualaglylysargglumetalaileilethrphelysasn505560glyalailepheglnvalgluvalproglyserglnhisileaspser65707580glnlyslysalailegluargmetlysaspthrleuargilealatyr859095leuthrglualalysvalglulysleucysvaltrpasnasnlysthr100105110prohisalailealaalailesermetalaasn115120<210>8<211>369<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8atcaagctgaagttcggcgtgttcttcaccgtgctgctgagcagcgcctacgcccacggc60accccccagaacatcaccgacctgtgcgccgagtaccacaacacccagatctacaccctg120aacgacaagatcttcagctacaccgagagcctggccggcaagcgcgagatggccatcatc180accttcaagaacggcgccatcttccaggtggaggtgcccggcagccagcacatcgacagc240cagaagaaggccatcgagcgcatgaaggacaccctgcgcatcgcctacctgaccgaggcc300aaggtggagaagctgtgcgtgtggaacaacaagaccccccacgccatcgccgccatcagc360atggccaac369<210>9<211>825<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>9metglnalagluglyargglythrglyglyserthrglyaspalaasp151015glyproglyglyproglyileproaspglyproglyglyasnalagly202530glyproglyglualaglyalathrglyglyargglyproargglyala354045glyalaalaargalaserglyproargglyglyalaproargglypro505560hisglyglyalaalaseralaglnaspglyargcysprocysglyala65707580argargproaspserargleuleugluleuhisilethrmetprophe859095serserprometglualagluleuvalargargileleuserargasp100105110alaalaproleuproargproglyalavalleulysaspphethrval115120125serglyasnleuleuphemetservalargaspglnaspargglugly130135140alaglyargmetargvalvalglytrpglyleuglyseralaserpro145150155160gluglyglnlysalaargaspleuargthrprolyshislysvalser165170175gluglnargproglythrproglyproproproprogluglyalagln180185190glyaspglycysargglyvalalapheasnvalmetpheseralapro195200205hisileproleugluglnargserglnhiscyslysprogluglugly210215220leuglualaargglyglualaleuglyleuvalglyalaglnalapro225230235240alathrglugluglnglualaalaserserserserthrleuvalglu245250255valthrleuglygluvalproalaalagluserproaspproprogln260265270serproglnglyalaserserleuprothrthrmetasntyrproleu275280285trpserglnsertyrgluaspserserasnglngluglugluglypro290295300serthrpheproaspleugluserglupheglnalaalaleuserarg305310315320lysvalalagluleuvalhispheleuleuleulystyrargalaarg325330335gluprovalthrlysalaglumetleuglyservalvalglyasntrp340345350glntyrphepheprovalilepheserlysalaserserserleugln355360365leuvalpheglyilegluleumetgluvalaspproileglyhisleu370375380tyrilephealathrcysleuglyleusertyraspglyleuleugly385390395400aspasnglnilemetprolysalaglyleuleuileilevalleuala405410415ileilealaarggluglyaspcysalaprogluglulysiletrpglu420425430gluleuservalleugluvalphegluglyarggluaspserileleu435440445glyaspprolyslysleuleuthrglnhisphevalglngluasntyr450455460leuglutyrargglnvalproglyseraspproalacystyrgluphe465470475480leutrpglyproargalaleuvalgluthrsertyrvallysvalleu485490495hishismetvallysileserglyglyprohisilesertyrpropro500505510leuhisglutrpvalleuarggluglyglugluglnalagluglyarg515520525glythrglyglyserthrglyaspalaaspglyproglyglyprogly530535540ileproaspglyproglyglyasnalaglyglyproglyglualagly545550555560alathrglyglyargglyproargglyalaglyalaalaargalaser565570575glyproglyglyglyalaproargglyprohisglyglyalaalaser580585590glyleuasnglycyscysargcysglyalaargglyprogluserarg595600605leuleugluphetyrleualametprophealathrprometgluala610615620gluleualaargargserleualaglnaspalaproproleuproval625630635640proglyvalleuleulysgluphethrvalserglyasnileleuthr645650655ileargleuthralaalaasphisargglnleuglnleuserileser660665670sercysleuglnglnleuserleuleumettrpilethrglncysphe675680685leuprovalpheleualaglnproproserglyglnargargilelys690695700leulyspheglyvalphephethrvalleuleuserseralatyrala705710715720hisglythrproglnasnilethraspleucysalaglutyrhisasn725730735thrglniletyrthrleuasnasplysilephesertyrthrgluser740745750leualaglylysargglumetalaileilethrphelysasnglyala755760765ilepheglnvalgluvalproglyserglnhisileaspserglnlys770775780lysalailegluargmetlysaspthrleuargilealatyrleuthr785790795800glualalysvalglulysleucysvaltrpasnasnlysthrprohis805810815alailealaalailesermetalaasn820825<210>10<211>2475<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10atgcaggccgaaggccggggcacagggggttcgacgggcgatgctgatggcccaggaggc60cctggcattcctgatggcccagggggcaatgctggcggcccaggagaggcgggtgccacg120ggcggcagaggtccccggggcgcaggggcagcaagggcctcggggccgagaggaggcgcc180ccgcggggtccgcatggcggtgccgcttctgcgcaggatggaaggtgcccctgcggggcc240aggaggccggacagccgcctgcttgagttgcacatcacgatgcctttctcgtcgccaatg300gaagcggagctggtccgcagaatcctgtcccgggatgccgcaccgctcccccgaccaggg360gcggttctgaaggacttcaccgtgtccggcaacctactgtttatgtcagttcgggaccag420gacagggaaggcgctgggcggatgagggtggtgggttgggggctgggatcagcctccccg480gaggggcagaaagctagagatctcagaacacccaaacacaaggtctcagaacagagacct540ggtacaccaggcccgccgccacccgagggagcccagggagatgggtgcagaggtgtcgcc600tttaatgtgatgttctctgcccctcacattcccctggagcagcgcagccagcactgcaag660cccgaggagggcctggaggcccgcggcgaggccctgggcctggtgggcgcccaggccccc720gccaccgaggagcaggaggccgccagcagcagcagcaccctggtggaggtgaccctgggc780gaggtgcccgccgccgagagccccgaccccccccagagcccccagggcgccagcagcctg840cccaccaccatgaactaccccctgtggagccagagctacgaggacagcagcaaccaggag900gaggagggccccagcaccttccccgacctggagagcgagttccaggccgccctgagccgc960aaggtggccgagctggtgcacttcctgctgctgaagtaccgcgcccgcgagcccgtgacc1020aaggccgagatgctgggcagcgtggtgggcaactggcagtacttcttccccgtgatcttc1080agcaaggccagcagcagcctgcagctggtgttcggcatcgagctgatggaggtggacccc1140atcggccacctgtacatcttcgccacctgcctgggcctgagctacgacggcctgctgggc1200gacaaccagatcatgcccaaggccggcctgctgatcatcgtgctggccatcatcgcccgc1260gagggcgactgcgcccccgaggagaagatctgggaggagctgagcgtgctggaggtgttc1320gagggccgcgaggacagcatcctgggcgaccccaagaagctgctgacccagcacttcgtg1380caggagaactacctggagtaccgccaggtgcccggcagcgaccccgcctgctacgagttc1440ctgtggggcccccgcgccctggtggagaccagctacgtgaaggtgctgcaccacatggtg1500aagatcagcggcggcccccacatcagctacccccccctgcacgagtgggtgctgcgcgag1560ggcgaggagcaggccgaaggccggggcacagggggttcgacgggcgatgctgatggccca1620ggaggccctggcattcctgatggcccagggggcaatgctggcggcccaggagaggcgggt1680gccacgggcggcagaggtccccggggcgcaggggcagcaagggcctcggggccgggagga1740ggcgccccgcggggtccgcatggcggcgcggcttcagggctgaatggatgctgcagatgc1800ggggccagggggccggagagccgcctgcttgagttctacctcgccatgcctttcgcgaca1860cccatggaagcagagctggcccgcaggagcctggcccaggatgccccaccgcttcccgtg1920ccaggggtgcttctgaaggagttcactgtgtccggcaacatactgactatccgactgact1980gctgcagaccaccgccaactgcagctctccatcagctcctgtctccagcagctttccctg2040ttgatgtggatcacgcagtgctttctgcccgtgtttttggctcagcctccctcagggcag2100aggcgcatcaagctgaagttcggcgtgttcttcaccgtgctgctgagcagcgcctacgcc2160cacggcaccccccagaacatcaccgacctgtgcgccgagtaccacaacacccagatctac2220accctgaacgacaagatcttcagctacaccgagagcctggccggcaagcgcgagatggcc2280atcatcaccttcaagaacggcgccatcttccaggtggaggtgcccggcagccagcacatc2340gacagccagaagaaggccatcgagcgcatgaaggacaccctgcgcatcgcctacctgacc2400gaggccaaggtggagaagctgtgcgtgtggaacaacaagaccccccacgccatcgccgcc2460atcagcatggccaac2475当前第1页1 2 3