一种基于滚环复制的质粒线性化方法及在感受态转化中的应用

本发明属于基因工程领域，尤其是一种基于滚环复制的质粒线性化方法及在sck6感受态转化中的应用。

背景技术：

枯草芽孢杆菌可以作为宿主应用于蛋白质的定向进化。但是枯草芽孢杆菌在dna突变体库的克隆与转化的遗传操作上并不像大肠杆菌那样简单易行。较为常见的转化方法包括：化学转化法，电转法，原生质体法，和碱金属离子法。分别在操作时间和操作难度上都有着各自的劣势。操作时间上基本要耗时一至两天，操作难度也需要一定的熟练度才可以达到稳定重复的结果，而基于超极感受态sck6的转化方法，简化了感受态的制备并且可以直接使用温浴进行转化，大大提高了转化效率，基于超极感受态的枯草芽孢杆菌的转化方法其中关键的步骤在于质粒的线性化，其中质粒片段的多聚体化使得质粒可以直接通过一步转化方法进入枯草芽孢杆菌的菌体内，相对于之前依赖物理化学方法使细胞形成感受态的方式而言，有高效性的特点。

技术实现要素：

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种基于滚环复制的质粒线性化方法及在sck6感受态转化中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于滚环复制的质粒线性化方法，按照下列步骤进行：

步骤一、准备bufferd1和buffern1；

步骤二、加入2.5μl或5μl体积的dna模板；

步骤三、加入2.5μl或5μl体积的bufferd1。震荡混匀并短暂离心；

室温下(15-25℃)静置3分钟；

步骤四、加入5μl或10μl体积的buffern1。震荡混匀并短暂离心；

步骤五、准备mastermix；

步骤六、加入40μl或30μl的mastermix到步骤5中的10μl或20μl体积的变性dna；

步骤七、30℃反应10-16h；

步骤八、将repli-gminidnapolymerase变性，65℃保温3min；

步骤九、将样品1:20在te中稀释进行pcr分析，每次pcr反应用3μl体积的稀释dna；4℃保存，-20℃长期保存；

所述bufferdlb、stopsolution、repli-gminireactionbuffer、repli-gminidnapolymerase均来自minikit。

一种基于滚环复制的质粒线性化方法在sck6感受态转化中的应用，按照下列步骤进行：

步骤一、sck6感受态的制备

1)接种新鲜的b.subtilissck6菌株的单菌落到3ml带有1μg/ml新霉素的lb培养基中；

2)菌株在37℃，200rpm的条件下培养过夜；

3)将隔夜培养的培养液使用新鲜的混有浓度为1％(w/v)木糖的lb培养基稀释，至浓度a600＝1，再次培养2小时；

4)此时的sck6细胞已处于感受态，使用10％的甘油分装储存至-80℃以备用。

步骤二、转化

1)在ep管中将1μl经过线性化的质粒与100μl的超级感受态细胞sck6混匀，所述经过线性化的质粒即为通过一种基于滚环复制的质粒线性化方法制备得到的质粒，在37℃，200rpm的摇床中培养90min；

2)由于sck6具有很高的转化效率，通常需要稀释10³-10⁴倍。并在具有适当抗生素的培养基上涂板过夜。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本方法中采取滚环复制扩增的方法代替重叠扩增的方法进行质粒的线性化，具有以下优点：

1.防止了pcr过程中可能引入的随机突变；

2.缩短了流程的时间；

3.可以在不建库的情况下使用；

4.转化效率达到至少10⁶转化子/μg，高于使用重叠扩增方法得到的转化子。

附图说明

图1为实施例中转化平板的结果图。

具体实施方式

下面结合附图与具体的实施方式对本发明作进一步详细描述：

步骤一、质粒的线性化：

1.准备bufferd1和buffern1；

2.加入2.5μl或5μl体积的dna模板；

3.加入2.5μl或5μl体积的bufferd1。震荡混匀并短暂离心；

室温下(15-25℃)静置3分钟；

4.加入5μl或10μl体积的buffern1。震荡混匀并短暂离心；

5.准备mastermix；

6.加入40μl或30μl的mastermix到步骤5中的10μl或20μl体积的变性dna；

7.30℃反应10-16h；

8.将repli-gminidnapolymerase变性，65℃保温3min；

9.将样品1:20在te中稀释进行pcr分析，每次pcr反应用3μl体积的稀释dna；4℃保存，-20℃长期保存；

所述bufferdlb、stopsolution、repli-gminireactionbuffer、repli-gminidnapolymerase均来自minikit。

步骤二、基于sck6的枯草芽孢杆菌的转化：

1.sck6感受态的制备

1)接种新鲜的b.subtilissck6菌株的单菌落到3ml带有1μg/ml新霉素的lb培养基中；

2)菌株在37℃，200rpm的条件下培养过夜；

3)将隔夜培养的培养液使用新鲜的混有浓度为1％(w/v)木糖的lb培养基稀释，至浓度a600＝1，再次培养2小时；

4)此时的sck6细胞已处于感受态，使用10％的甘油分装储存至-80℃以备用。

2.转化

1)在ep管中将1μl经过线性化的质粒与100μl的超级感受态细胞sck6混匀，在37℃，200rpm的摇床中培养90min；

2)由于sck6具有很高的转化效率，通常需要稀释10³-10⁴倍。并在具有适当抗生素的培养基上涂板过夜。

在现有sck6感受态细胞的转化试验方法中，质粒的线性化借助overlappcr步骤完成，overlappcr的方法适用于建库使用，实际上是将质粒多聚体化，本方法采用基于滚环复制的原理的repli-g试剂盒进行质粒的线性化以达到同样的技术效果，经过测试可以得到质量更好的线性化片段，和更高的转化效率(10⁶转化子/μg)可以满足易错pcr建库的对于转化效率的要求。转化的结果如图1所示，2.5μl质粒转化200μl感受态细胞，稀释1000倍涂板，具有4000个克隆。

以上对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。