马铃薯核酸提取装置及方法与流程

本发明属于分子生物学实验领域，具体的说是生物样品核酸提取装置及方法。

背景技术：

核酸提取是生物化学和分子生物学实验必需的实验过程，提取dna和rna的实验原理各不相同，但均包含研磨破坏细胞结构，溶解使核酸进入相应溶液，沉淀或吸附使核酸分离，洗涤去除杂质，洗脱使核酸溶于溶液等步骤。

dna的提取常采用ctab法，ctab全称十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/lnacl)，ctab与蛋白质和多聚糖形成复合物，但不会沉淀核酸。再通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀，即可使核酸分离出来。

rna的提取主要有异硫氰酸胍/苯酚法（trizol）和胍盐/β-巯基乙醇法。异trizol法是一种传统的rna提取方法，适用于大部分动植物材料，但对于次生代谢产物较多的植物材料提取rna效果较差。异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离，并将rna释放到溶液中，采用酸性酚-氯仿混合液抽提，低ph值的酚将使rna进入水相，而蛋白质和dna仍留在有机相，从而可以完成rna的提取工作。胍盐/β-巯基乙醇法适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料。在这种方法中，胍盐使细胞充分裂解，β-巯基乙醇作为蛋白的变性剂在实验全程中可以抑制rnasea的活性，保护rna不被降解。

现有技术存在的问题：提取核酸时样品研磨费时费力，而且容易污染样品，试剂挥发影响实验员安全。提取核酸的吸附、洗涤、洗脱等步骤需要反复离心，操作繁琐。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明提供了生物样品核酸提取装置及方法，采用钢珠在液氮中振动研磨样品，并采用多级滤芯的离心管，简化核酸提取过程。

为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种马铃薯核酸提取装置，包括震荡研磨器和多级离心管，震荡研磨器结构包括：顶盖的顶部设有把手，电机安装在顶盖内部中央，电机的转轴连接转子，转子外周设有放置研磨管的孔，顶盖放置在液氮槽内，并卡在突圈上，吸盘安装在液氮槽，钢珠放置在研磨管内；多级离心管结构包括：收集管内放置吸附柱，吸附柱内设有一圈卡凸，附柱设有密封盖，洗涤液柱放入附柱内卡凸上方，附柱内部下方设有滤网，洗涤液柱内有橡皮塞的底面上设有小孔。

优选的，顶盖为圆形，中空，通过螺丝可以拆卸上表面，

优选的，电机的转轴通过设有橡皮圈的轴承穿过顶盖下表面，

优选的，转子为一圆盘，电机的转轴连接转子中心以外1-15cm，形成偏心转子。

优选的，转子上放置研磨管的孔内设有弹簧，能够卡住研磨管。

优选的，液氮槽为圆形桶装，由后1-5cm钢材制成，厚重而使电机转动时稳定。

优选的，液氮槽还可以设置螺栓，顶盖对应螺栓位置设有一圈凹槽，向内拧紧固定顶盖，避免转动时顶盖脱落。

优选的，吸盘为橡胶制成，碗状，可以吸附在实验台或地面上，减少装置振动。

优选的，研磨管为金属制成，大小和形状如2ml离心管，由螺纹连接的两部分组成。内部空间呈圆形弧面，利于钢珠在其中转动研磨。

优选的，钢珠分为两种，适用于不同的试验方案，一种是表面光滑的普通普通钢柱，只具有研磨功能；另一种是设有许多钢珠孔，珠孔内填塞核酸吸附材料，能够在研磨的同时吸附核酸。核酸吸附材料包括：纸纤维：3％～15％，硅粉：3％～20％，羧甲基纤维素：5％～15％，余量为水。将上述材料加热溶解形成混合物，然后搅拌匀浆；将含有小孔的钢珠让入混合物中搅拌，取出放置在60℃烤箱中烘烤30min或在常温下自然干燥，得到含核酸吸附材料的钢珠。

优选的，吸附柱外檐直径大于收集管直径，而避免落入收集管内。

优选的，吸附柱内还可以不设卡凸，吸附柱不设密封盖，而将密封盖设在洗涤液柱上，形成吸附柱套在收集管内，洗涤液柱套在吸附柱内。

优选的，滤网为圆台形，外周为一圈橡皮，中央为核酸吸附材料制成的滤网，滤网能够与吸附柱密封，并通过镊子能够取出。

优选的，洗涤液柱用于储存洗涤液，内部设有隔板，隔板中央设有圆形孔，圆台形橡皮塞堵住小孔。橡皮塞设有不同规格，在较小离心力的作用下橡皮塞堵住小孔，在较大离心力的作用下橡皮塞从小孔脱出，落在底面上，装在洗涤液柱内的液体流出进入吸附柱。经测试，隔板小孔直径0.5mm，橡皮塞采用天然橡胶或丙烯酸酯橡胶，小头直径0.45mm，大头直径0.6mm，在10000rmp时测试的5个橡皮塞16均能够堵住小孔，在12000rmp时测试的5个橡皮塞16均能够从小孔脱出。

一种dna提取方法，包括如下步骤：

（1）将约300mg样品加入研磨管中，放入3-6粒钢珠，拧紧研磨管，放入转子的孔里。

（2）液氮槽加入液氮，顶盖3放入其中，拧紧螺栓。液氮高度低于转子5的高度，即不淹没转子。

（3）启动电机，转子偏心转动，研磨管内的钢珠往复运动进行研磨。根据样品种类不同，调节研磨时间，植物样品应当适当延长研磨时间。

（4）研磨结束后，取出研磨管，拧开并加入400ul2%ctab抽提缓冲液，上下颠倒数次后加入400ul氯仿-异戊醇（24：1），再上下颠倒数次，放入离心机中12000rpm离心5min。

（5）吸附柱放入收集管中，吸取离心后的上清液300ul加入吸附柱内，再加入300ul异丙醇，盖上吸附柱的密封盖上下颠倒数次；再将洗涤液柱放入吸附柱中，加入400ul75%乙醇，放入离心机中8000rpm离心5min后，离心机不开盖紧接着再12000rpm离心5min。加入异丙醇后dna沉淀，8000rpm离心去除异丙醇，12000rpm离心使橡皮塞脱出，75%乙醇进入吸附柱，对dna进行漂洗。

（6）用镊子将滤网夹出，直接放入另一普通离心管内，超净工作台风干2min，加入50ul水震荡溶解dna。后续实验取用dna溶液时，直接从离心管中吸取，无需将滤网取出。

一种rna提取方法，包括如下步骤：

（1）提取前多级离心管、普通离心管、镊子等均用depc水溶液浸泡，并121℃高温灭活30min。

（2）将约300mg样品加入研磨管中，放入3-6粒钢珠，拧紧研磨管，放入转子的孔里。

（3）液氮槽加入液氮，顶盖放入其中，拧紧螺栓。液氮高度低于转子的高度，即不淹没转子。

（4）启动电机，转子偏心转动，研磨管内的钢珠往复运动进行研磨。根据样品种类不同，调节研磨时间，植物样品应当适当延长研磨时间。

（5）研磨结束后，取出研磨管，拧开并加入300ultrizol，上下颠倒数次后加入300ul氯仿，振荡混匀后室温放置15min，放入离心机中12000rpm离心5min。

（6）吸附柱放入收集管中，吸取离心后的上清液300ul加入吸附柱内，再加入300ul异丙醇，盖上吸附柱的密封盖上下颠倒数次；再将洗涤液柱放入吸附柱中，加入400ul75%乙醇，放入离心机中8000rpm离心5min后，离心机不开盖紧接着再12000rpm离心5min。加入异丙醇后rna沉淀，8000rpm离心去除异丙醇，12000rpm离心使橡皮塞脱出，75%乙醇进入吸附柱，对rna进行漂洗。

（7）用镊子将滤网夹出，直接放入另一普通离心管内，超净工作台风干2min，加入50ul水震荡溶解rna。后续实验取用rna溶液时，直接从离心管中吸取，无需将滤网取出。

附图说明

图1为震荡研磨器结构示意图；

图2为震荡研磨器结构转子俯视图；

图3为研磨管结构示意图；

图4为研磨管安装示意图；

图5为带孔钢珠结构示意图；

图6为多级离心管结构示意图；

图7为多级离心管一级滤芯结构示意图；

图8为多级离心管二级滤芯结构示意图；

其中，把手1，电机2，顶盖3，研磨管4，转子5，突圈6，液氮槽7，吸盘8，转轴9，钢珠10，密封盖11，洗涤液柱12，卡凸13，吸附柱14，收集管15，橡皮塞16，底面17，滤网18，弹簧19，螺栓20，钢珠孔21，核酸吸附材料22。

具体实施方式

为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

该实施例提供一种优化的dna提取ctab法，包括如下步骤：

（1）2%ctab抽提缓冲液在65℃水浴中预热；

（2）取少量实验材料（约300mg）置于研钵中，用液氮磨至粉状；

（3）加入700ul的2%ctab抽提缓冲液，轻轻搅动；

（4）将磨碎液分倒入1.5ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；

（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，30~60min后取出；

（6）冷却2min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3min（若提取的是总基因组，则不能剧烈震荡），使两者混合均匀；

（7）放入离心机中12000rpm离心10min，与此同时，将600ul的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；

（8）12000rpm离心1min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到dna絮状物；

（9）12000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色dna沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；

（10）60sec后，直立离心管，加入720ul的75%乙醇及80ul5m的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的dna块状物浮游于液体中；

（11）放置30min，使dna块状物的不纯物溶解；

（12）10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800ul75%的乙醇，将dna再洗30min；

（13）12000rpm离心30sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥dna（自然风干或用风筒吹干）；

（14）加入50ul0.5×te(含rnase)缓冲液，使dna溶解，置于37℃恒温箱约15h，使rna消解；

实施例2

该实施例提供一种优化的rna提取trizol法，包括如下步骤：

（1）液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml加入trizol，转入离心管。

（2）细胞或组织加trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。

（3）4℃12000rpm离心5min，取上清液，等体积加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。

（4）4℃12000rpm离心15min后分三层，吸取上层水相，至另一离心管中。

（5）加入等体积异丙醇混匀，室温放置5-10min。

（6）4℃12000rpm离心10min，弃上清，rna沉于管底。

（7）按离心管1/2体积加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，洗涤。

（8）4℃8000rpm离心5min，尽量弃上清。

（9）室温或4℃真空干燥5-10min。

（10）用50ulh2o溶解rna样品，保存备用。

实施例3

该实施例提供一种震荡研磨器，如附图1-5所示，其结构包括：顶盖3的顶部设有把手1，电机2安装在顶盖3内部中央，电机2的转轴9连接转子5，转子5外周设有放置研磨管4的孔，顶盖3放置在液氮槽7内，并卡在突圈6上，吸盘8安装在液氮槽7，钢珠10放置在研磨管4内。

进一步地，顶盖3为圆形，中空，通过螺丝可以拆卸上表面，

进一步地，电机2的转轴通过设有橡皮圈的轴承穿过顶盖3下表面，

进一步地，转子5为一圆盘，电机2的转轴9连接转子5中心以外1-15cm，形成偏心转子。

进一步地，转子5上放置研磨管4的孔内设有弹簧19，能够卡住研磨管4。

进一步地，液氮槽7为圆形桶装，由后1-5cm钢材制成，厚重而使电机2转动时稳定。

进一步地，液氮槽7还可以设置螺栓20，顶盖3对应螺栓20位置设有一圈凹槽，向内拧紧固定顶盖3，避免转动时顶盖3脱落。

进一步地，吸盘8为橡胶制成，碗状，可以吸附在实验台或地面上，减少装置振动。

进一步地，研磨管4为金属制成，大小和形状如2ml离心管，由螺纹连接的两部分组成。内部空间呈圆形弧面，利于钢珠10在其中转动研磨。

进一步地，钢珠10分为两种，适用于不同的试验方案，一种是表面光滑的普通普通钢柱，只具有研磨功能；另一种是设有许多钢珠孔21，珠孔21内填塞核酸吸附材料22，能够在研磨的同时吸附核酸。核酸吸附材料22包括：纸纤维：3％～15％，硅粉：3％～20％，羧甲基纤维素：5％～15％，余量为水。将上述材料加热溶解形成混合物，然后搅拌匀浆；将含有小孔的钢珠10让入混合物中搅拌，取出放置在60℃烤箱中烘烤30min或在常温下自然干燥，得到含核酸吸附材料的钢珠10。

实施例4

该实施例提供一种多级离心管，如附图6-8所示，其结构包括：收集管15内放置吸附柱14，吸附柱14内设有一圈卡凸13，附柱14设有密封盖11，洗涤液柱12放入附柱14内卡凸13上方，附柱14内部下方设有滤网18，洗涤液柱12内有橡皮塞16的底面17上设有小孔。

进一步地，吸附柱14外檐直径大于收集管15直径，而避免落入收集管15内。

进一步地，吸附柱14内还可以不设卡凸13，吸附柱14不设密封盖11，而将密封盖11设在洗涤液柱12上，形成吸附柱14套在收集管15内，洗涤液柱12套在吸附柱14内。

进一步地，滤网18为圆台形，外周为一圈橡皮，中央为核酸吸附材料（参考实施例3）制成的滤网，滤网18能够与吸附柱14密封，并通过镊子能够取出。

进一步地，洗涤液柱12用于储存洗涤液，内部设有隔板，隔板中央设有圆形孔，圆台形橡皮塞16堵住小孔。橡皮塞16设有不同规格，在较小离心力的作用下橡皮塞16堵住小孔，在较大离心力的作用下橡皮塞16从小孔脱出，落在底面17上，装在洗涤液柱12内的液体流出进入吸附柱14。经测试，隔板小孔直径0.5mm，橡皮塞16采用天然橡胶或丙烯酸酯橡胶，小头直径0.45mm，大头直径0.6mm，在10000rmp时测试的5个橡皮塞16均能够堵住小孔，在12000rmp时测试的5个橡皮塞16均能够从小孔脱出。

实施例5

该实施例提供一种dna提取方法，结合实施例3和4的装置，包括如下步骤：

（1）将约300mg样品加入研磨管4中，放入3-6粒钢珠10，拧紧研磨管4，放入转子5的孔里。

（2）液氮槽7加入液氮，顶盖3放入其中，拧紧螺栓20。液氮高度低于转子5的高度，即不淹没转子5。

（3）启动电机2，转子5偏心转动，研磨管4内的钢珠10往复运动进行研磨。根据样品种类不同，调节研磨时间，植物样品应当适当延长研磨时间。

（4）研磨结束后，取出研磨管4，拧开并加入400ul2%ctab抽提缓冲液，上下颠倒数次后加入400ul氯仿-异戊醇（24：1），再上下颠倒数次，放入离心机中12000rpm离心5min。

（5）吸附柱14放入收集管15中，吸取离心后的上清液300ul加入吸附柱14内，再加入300ul异丙醇，盖上吸附柱14的密封盖11上下颠倒数次（若吸附柱14不设有密封盖11则底部旋转混匀）；再将洗涤液柱12放入吸附柱14中，加入400ul75%乙醇，放入离心机中8000rpm离心5min后，离心机不开盖紧接着再12000rpm离心5min。加入异丙醇后dna沉淀，8000rpm离心去除异丙醇，12000rpm离心使橡皮塞16脱出，75%乙醇进入吸附柱14，对dna进行漂洗。

（6）用镊子将滤网18夹出，直接放入另一普通离心管内，超净工作台风干2min，加入50ul水震荡溶解dna。后续实验取用dna溶液时，直接从离心管中吸取，无需将滤网18取出。

实施例6

该实施例提供一种dna提取方法，结合实施例3和4的装置以及带孔钢珠，包括如下步骤：

（1）按如下比例混合：纸纤维：3％～15％，硅粉：3％～20％，羧甲基纤维素：5％～15％，余量为水。上述材料加热溶解形成混合物，然后搅拌匀浆；将含有小孔的钢珠10让入混合物中搅拌30min，取出放置在60℃烤箱中烘烤30min或在常温下自然干燥，得到含核酸吸附材料的钢珠10，如附图5所示。

（2）将约300mg样品加入研磨管4中，放入3-6粒上述带孔钢珠10，拧紧研磨管4，放入转子5的孔里。

（3）液氮槽7加入液氮，顶盖3放入其中，拧紧螺栓20。液氮高度低于转子5的高度，即不淹没转子5。

（4）启动电机2，转子5偏心转动，研磨管4内的钢珠10往复运动进行研磨。根据样品种类不同，调节研磨时间，植物样品应当适当延长研磨时间。

（5）研磨结束后，取出研磨管4，拧开并加入400ul2%ctab抽提缓冲液，上下颠倒数次后加入400ul氯仿-异戊醇（24：1），再上下颠倒数次，用磁棒将钢珠吸出，并用移液枪吸取75%乙醇冲洗数次。

（6）钢珠10放入普通离心管中，加入200ul水震荡溶解dna。后续实验取用dna溶液时，直接从离心管中吸取，无需将钢珠10取出。

实施例7

该实施例提供一种rna提取方法，结合实施例3和4的装置，包括如下步骤：

（1）提取前多级离心管、普通离心管、镊子等均用depc水溶液浸泡，并121℃高温灭活30min。

（2）将约300mg样品加入研磨管4中，放入3-6粒钢珠10，拧紧研磨管4，放入转子5的孔里。

（3）液氮槽7加入液氮，顶盖3放入其中，拧紧螺栓20。液氮高度低于转子5的高度，即不淹没转子5。

（4）启动电机2，转子5偏心转动，研磨管4内的钢珠10往复运动进行研磨。根据样品种类不同，调节研磨时间，植物样品应当适当延长研磨时间。

（5）研磨结束后，取出研磨管4，拧开并加入300ultrizol，上下颠倒数次后加入300ul氯仿，振荡混匀后室温放置15min，放入离心机中12000rpm离心5min。

（6）吸附柱14放入收集管15中，吸取离心后的上清液300ul加入吸附柱14内，再加入300ul异丙醇，盖上吸附柱14的密封盖11上下颠倒数次（若吸附柱14不设有密封盖11则底部旋转混匀）；再将洗涤液柱12放入吸附柱14中，加入400ul75%乙醇，放入离心机中8000rpm离心5min后，离心机不开盖紧接着再12000rpm离心5min。加入异丙醇后rna沉淀，8000rpm离心去除异丙醇，12000rpm离心使橡皮塞16脱出，75%乙醇进入吸附柱14，对rna进行漂洗。

（7）用镊子将滤网18夹出，直接放入另一普通离心管内，超净工作台风干2min，加入50ul水震荡溶解rna。后续实验取用rna溶液时，直接从离心管中吸取，无需将滤网18取出。

实施例8

该实施例提供一种rna提取方法，结合实施例3和4的装置以及带孔钢珠，包括如下步骤：

（1）按如下比例混合：纸纤维：3％～15％，硅粉：3％～20％，羧甲基纤维素：5％～15％，余量为水。上述材料加热溶解形成混合物，然后搅拌匀浆；将含有小孔的钢珠10让入混合物中搅拌30min，取出放置在60℃烤箱中烘烤30min或在常温下自然干燥，得到含核酸吸附材料的钢珠10，如附图5所示。

（2）多级离心管、普通离心管、镊子等均用depc水溶液浸泡，并121℃高温灭活30min。

（2）将约300mg样品加入研磨管4中，放入3-6粒上述带孔钢珠10，拧紧研磨管4，放入转子5的孔里。

（3）液氮槽7加入液氮，顶盖3放入其中，拧紧螺栓20。液氮高度低于转子5的高度，即不淹没转子5。

（4）启动电机2，转子5偏心转动，研磨管4内的钢珠10往复运动进行研磨。根据样品种类不同，调节研磨时间，植物样品应当适当延长研磨时间。

（5）研磨结束后，取出研磨管4，拧开并加入300ultrizol，上下颠倒数次后加入300ul氯仿，再上下颠倒数次，用磁棒将钢珠吸出，并用移液枪吸取75%乙醇冲洗数次。

（6）钢珠10放入普通离心管中，加入200ul水震荡溶解rna。后续实验取用rna溶液时，直接从离心管中吸取，无需将钢珠10取出。

有益效果：本发明至少具有以下优点：研磨过程中液氮不接触样品，避免样品污染。液氮不直接加入研钵，挥发少，节约液氮。自动研磨减少了实验劳动强度，且能够根据不同样品控制研磨时间，同时在液氮环境中研磨保证了核酸的完整性。滤网18直接让入离心管中溶解核酸，能够最大限度的减少核酸损失。提取过程大大减少离心的次数，简化了实验过程。实验利用马铃薯组培苗，采用实施例5所述方法最终提取得到dna的浓度为315ng/ul，od260/od280=1.92，采用实施例7所述方法最终提取得到rna的浓度为224ng/ul，od260/od280=2.03，该方法能够提取纯度符合实验要求的核酸。

本发明能够适用包括马铃薯在内的所有植物样品和块状动物样品的核酸提取。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。