拟南芥转录因子AT3G46090基因在培育抗病性转基因植物中的应用

本发明属于遗传工程领域，具体地说，涉及拟南芥转录因子at3g46090基因在培育抗病性转基因植物中的应用。

背景技术：

我国作为人口大国，每年对粮食的需求量巨大。农业生产中农作物的产量会受各种因素的影响导致减产，其中病虫害是影响全球农业生产的重要因素之一。现在对农作物病虫害的防治主要采取化学药剂或生物防治的办法，但是这两种常见方法会引起二次污染，或其他一些生态危害。因此利用现代生物技术挖掘广谱抗性基因，为传统育种技术提供指导是十分必要的。现在已有一些广谱的抗病基因被挖掘到。对抗病相关基因进行进一步挖掘及拓展，为育种工作者提供更多的选择对未来的农作物生产具有重大意义。

技术实现要素：

发明人针对筛选获得的一个拟南芥转录抑制因子at3g46090进行了基因克隆、转基因植物构建及初步的抗病分析，发现该基因在植物抗病中发挥功能，该基因在不同物种中具有一定的保守性，后期或可进行农作物的抗病育种及改良。

作为本发明的一个方面，提供了拟南芥转录因子at3g46090基因在培育抗病性转基因植物中的应用。

进一步的，所述应用具体包括，克隆转录因子at3g46090基因的cds序列，其序列如seqidno.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列；利用gateway技术构建融合表达载体，该载体可在植物中表达融合蛋白at3g46090-linker-flag，其中linker为gateway载体重组位点编码的氨基酸序列ypaflykvvdns，flag标签的氨基酸序列为dykddddk，at3g46090为拟南芥转录因子at3g46090编码的氨基酸序列；转化植物，筛选，鉴定，获得具有抗病性的转基因植物。

作为本发明的另一个方面，提供了前述载体及含有该载体的工程菌及含有该载体的转基因细胞系。

本发明的有益效果：本发明对拟南芥转录因子at3g46090进行克隆和表达载体的构建，并转化到植物中进行研究，对筛选到的植物进行分析发现其可增强植物的抗病性，对农作物中同源基因可能具有同样的功能，因此在生产中具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中pgwb11的载体图谱；

图2为本发明实施例1中pgwb11-at3g46090载体图谱；

图3为本发明实施例5中拟南芥接种丁香假单胞菌番茄亚种的表型分析，其中，左侧为拟南芥col-0，右侧为at3g46090转基因拟南芥株系。

具体实施方式：

本发明提供的项目实施方案用于说明本发明，但是不局限于本发明的研究范围。如果没有特别指出，本发明实施中的技术手段为本研究领域的常用技术，所用原料为市场所购。

实施例1拟南芥转录因子at3g46090基因序列的获得以及植物表达载体的构建。

登录拟南芥信息资源数据库网站https://www.arabidopsis.org/servlets/tairobject？type＝sequence&id＝30046，找到转录因子at3g46090基因的序列(seqidno.1)，根据at3g46090基因的cds设计pcr扩增引物，

at3g46090-f:5'-atggttgcgagaagtgaggaa-3'

at3g46090-r:5'-ttaactccaagaaatcgttct-3'

培养野生型拟南芥col-0，取短日照生长3周的拟南芥叶片为材料，trizol法提取植物总rna，经反转录pcr获得cdna，随后以cdna为模板扩增目的序列。

提取rna具体步骤如下：在液氮环境中将拟南芥叶片研磨粉碎，待液氮完全挥发后，将样品分装至装有1mltrizol的离心管中快速混匀，室温静置，酚氯仿抽提两次，取上清，而后用等体积异丙醇沉淀20分钟，低温高速离心，弃上清后用乙醇洗沉淀两次，待吹干乙醇后用20μlrnase-free的去离子水溶解即为提取好的rna。

反转录pcr方法如下：离心管中依次加入取2μl拟南芥总rna(1μg)、10μl不含核酸酶的ddh2o、4μl5*反应缓冲液、1μloligo(dt)18引物、2μldntp、1μlrnase抑制剂及1μl反转录酶，混合均匀后42℃反应1小时,70℃处理5min终止反应，即为反转录的cdna。将cdna稀释后依次加入pcr缓冲液、dntp、引物、dna聚合酶和不含核酸酶的ddh2o后用pcr仪进行扩增反应，程序如下，热启动98℃10s，60℃5s，72℃15s，30个循环后，72℃延伸5min。

获得拟南芥转录因子at3g46090基因的cds序列：按照primestar聚合酶扩增体系和反应程序进行pcr。根据gateway克隆技术的要求，此过程中包含两轮pcr，第一轮pcr的引物用加部分adaptorattb接头的引物，而第二轮的模板用第一轮的pcr产物，并且引物采用完整的adaptorattb引物。将pcr产物克隆到连接pdonr克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。通过lr反应将at3g46090基因构建到植物表达载体pgwb11(图1)上，获得载体at3g46090-flag::pgwb11(图2)，该载体全序列如seqidno.2所示。该载体具有在植物中表达融合蛋白at3g46090-linker-flag的功能，其中linker为gateway载体重组位点编码的氨基酸序列ypaflykvvdns，flag标签的氨基酸序列为dykddddk；at3g46090为拟南芥转录因子at3g46090编码的氨基酸序列(seqidno.3)。

实施例2转基因拟南芥植株的获得

首先植物培养至开花期，随后用农杆菌蘸花法进行转化，收取种子后进行转基因植物的筛选。

植物培养的方法：

取足量拟南芥种子装入离心管中进行表面消毒。首先用75％乙醇表面消毒30s，无菌水漂洗一次，接着用1％naclo表面消毒5-8min后，用无菌水漂洗三次；完成表面消毒后，将处理好的种子播种于1/2ms培养基平板上。将点好的平板用parafilm膜封口，并放于4℃黑暗处理。2-4天后将平板放置于植物光照培养箱(光照周期为12h光照/12h黑暗)。待种子萌发后8天，将拟南芥幼苗转载至营养土，同样光照条件下进行生长，定期浇水。待上述培养的拟南芥生长至6-8周时，剪去成熟的果荚，用以准备转化。

农杆菌蘸花法转化：

将植物表达载体at3g46090-flag::pgwb11转化农杆菌gv3101(pmd19)，并筛选阳性克隆；将阳性克隆用yeb于28℃进行培养，随后以1:100比例接种至200mlyeb液体培养基扩大培养，室温离心收集菌体，并将之重悬于新配的5％蔗糖溶液；在蘸花转化前，在菌悬液中加入终浓度为0.02％的silwetl-77，混匀后将拟南芥花序浸泡于菌液中30s，将植物平放于黑暗高湿环境中16-24h后，正常培养至种子成熟，收取种子以备筛选。

转基因植物的筛选：

将收取的拟南芥种子经表面消毒处理后(处理方法同上)，平铺于含有50mg/l卡那霉素抗性的1/2ms平板，经4℃黑暗处理两天后，置于植物光照培养箱培养；7-10天后可见明显的转化子表型。成功的转化子正常生长，而未成功转化的植物黄化并且不再生长。将获得的转化子转移至营养土中进一步生长，按期浇水管理。3-4周后，将拟南芥叶片提取基因组dna进行进一步鉴定。

实施例3转基因拟南芥的验证

以转基因植物的叶片为材料提取基因组dna，并进行pcr验证，确认at3g46090-flagdna片段插入拟南芥基因组。

基因组dna的提取：

取50mg待检测的正常生长的拟南芥叶片研磨后加入400μl植物基因组dna提取液(200mmtris-clph7.4，250mmnacl，25mmedta，1％sds)，涡旋混匀后高速离心5min，吸取上清并加入等体积异丙醇，室温沉淀30min，高速离心5min后弃上清，用70％乙醇清洗沉淀两次，将沉淀溶解于20μl无核酸酶的ddh2o。

利用pgwb11载体的特异引物进行pcr扩增：

以上述提取的基因组dna为模板进行pcr，体系包括5*缓冲液4μl、上游引物及下游引物各1μl、10mmdntp0.5μl、基因组dna1μl、taq聚合酶0.5μl和无核酸酶的ddh2o12μl。pcr程序为热启动95℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环后，72℃延伸5min，结束反应。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，转化子基因组dna中可以扩增得到目标条带，而未转化的不能得到目标条带。

pgwb11特异引物为：

pgwb11-f:5'-gggactctagagttatca-3'

pgwb11-r:5'-gggaaattcgagctctaagc-3'

实施例4转基因植物的wb检测

取生长4周的植物叶片1g，用液氮速冻，并迅速将植物叶片研磨粉碎，在蛋白提取缓冲液中混匀，13000g离心15分钟，即为蛋白粗提液。配置12％分离胶、4％浓缩胶的sds-page。取10ul蛋白粗提液进行电泳检测。首先80v的低电压电泳30分钟，使蛋白样品跑至同一条线，然后再120v的高电压下电泳90分钟左右，直至溴酚蓝条带跑到底端，停止电泳。电泳后利用湿转法转膜约60分钟，接着用丽春红染液进行染色观察，确定转膜质量；然后将膜置于含有5％脱脂奶粉pbst溶液中封闭60分钟，接着用一抗flag单抗隆抗体(sigma，cat号为：f2555)孵育2小时，完成后用pbst洗涤3次，每次10分钟；随后用5％的pbst脱脂奶粉封闭30分钟，用二抗山羊抗兔igg(h&l,hrp,货号ab6721)标记2小时，最后用pbst洗涤3次，每次5分钟，在膜上加入底物，黑暗条件下进行曝光。鉴定结果表明在野生型col-0中没有发现flag出现的蛋白条带，但是在转基因植物中存在可以被flag抗体识别且大小符合预测的蛋白条带。

实施例5转基因拟南芥植株的抗病表型分析

本发明中施用的病原菌为丁香假单胞菌番茄亚种(pstdc3000)。该病原菌可侵染包括番茄、拟南芥等在内的植物。

首先将病原细菌pstdc3000菌种涂布于含有20mg/ml利福平的lb培养基，28℃黑暗培养，待生长出单克隆后挑取单克隆于2ml加有利福平的lb培养基过夜培养。将过夜培养的菌液离心收集菌体，并用10mmmgcl2洗菌体两次，最后用10mmmgcl2重悬菌体并调节至合适浓度。将菌悬液分别注射野生型及转基因拟南芥叶片，并以注射10mmmgcl2的为对照，3天后观察表型，结果如图3所示，野生型拟南芥叶片(左)病原菌大量增殖，呈现黄色病斑，而转基因拟南芥的叶片(右)几乎无表征或者呈现坏死，病原菌的增殖受到抑制。

以上提供的实施例是将拟南芥at3g46090基因的cds序列通过gateway技术构建到带有flag蛋白标签的上游，并成功转化拟南芥，该基因的表达可影响拟南芥抗病表型。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽描述，但在本发明基础上，可以对之稍作修改或改进，这对本领域技术人员是显而易见的。同样的，将拟南芥at3g46090的cds序列构建到其他蛋白标签的上游或下游也可以达到相应效果。因此，在不偏离本发明的精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。。

序列表

<110>江苏师范大学

<120>拟南芥转录因子at3g46090基因在培育抗病性转基因植物中的应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>507

<212>dna

<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)

<400>1

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<210>2

<211>16103

<212>dna

<213>载体(at3g46090-flag::pgwb11)

<400>2

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