DLX1和HOXC6在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒的制作方法

本发明涉及一种dlx1和hoxc6在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒，属于生物医药技术领域。

背景技术：

前列腺癌(prostatecancer，pca)是一种严重威胁男性健康的恶性肿瘤，占全球肿瘤发病率第二位、死亡率第六位，我国pca的发病率平均每年增长4.7％，是增加最快的男性恶性肿瘤。上海市疾病控制中心的资料显示，前列腺癌的发病率自2002年起已跃居男性泌尿生殖系恶性肿瘤的首位。

前列腺特异性抗原(prostatespecificantigen,psa)是全世界应用最广泛的前列腺癌早期诊断指标，psa升高提示患者可能存在前列腺癌，但psa升高也往往因其他的前列腺疾病引起。以psa灰区(4-10ng/ml)为例，这些患者穿刺活检的阳性率只有10-25％。据统计全世界每年接受前列腺穿刺活检，其中75％以上是不必要的，穿刺活检会给患者带来许多并发症，如血尿、败血症、感染等，给患者带来极大的痛苦。虽然psa应用广泛，但也存在上述等较大问题，亟需新的检测靶标来弥补其缺陷。

dlx基因家族是一组转录因子，在胚胎发育阶段启动调控作用。dlx1是dlx基因家族中的重要原癌基因，hoxc6是同源盒基因家族成员，是一种重要的转录因子，在器官形成中起到调控作用。dlx1和hoxc6都与前列腺的恶性进展密切相关。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术中的缺点，本发明提供一种多个前列腺相关基因表达联合检测试剂盒及应用，其能够联合检测前列腺相关基因表达，可以明显地提高肿瘤的检出率，其设计巧妙，使用方便，适于大规模推广应用。

为达到以上目的，本发明提供一种dlx1和hoxc6在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒。其能够联合检测前列腺相关基因表达，可以明显地提高肿瘤的检出率，其设计巧妙，使用方便，适于大规模推广应用。

dlx1和hoxc6在制备诊断前列腺癌标志物中的联合应用，所述dlx1的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述hoxc6的核苷酸序列如seqidno.2所示。

dlx1和hoxc6联合检测前列腺癌的试剂盒，包括dlx1mrna、和hoxc6mrna的定量检测试剂；所述dlx1mrna定量检测试剂包括seqidno.7和seqidno.8所示的检测引物和核苷酸序列如seqidno.9所示的探针；所述hoxc6mrna定量检测试剂包括如seqidno.10和seqidno.11所示的检测引物和核苷酸序列如seqidno.12所示的探针。

优选地，上述试剂盒还包括psamrna定量检测试剂，所述psamrna定量检测试剂包括如seqidno.13和seqidno.14所示的检测引物和核苷酸序列如seqidno.15所示的探针。

优选地，上述试剂盒还包括一步法rt-pcr反应液，包括one-steprt/rienzymemix，probeqpcrsupermix。

优选地，上述试剂盒还包括两步法rt-pcr试剂：包括引物探针混合液，rt反应液和pcr反应液；所述rt反应液包括5×buffer，dntp，hiscriptiiireversetranscriptase，随机引物，oligo(dt)和水；所述pcr反应液包括2×buffer，dntp，mg²⁺，acetaqdnapolymerase和水。

优选地，上述试剂盒还包括标准品，阴性质控品和阳性质控品；所述标准品包括如seqidno.4所示的dlx1基因重组质粒、如seqidno.5所示的hoxc6基因重组质粒、如seqidno.6所示的psa基因重组质粒；阳性质控品为前列腺癌细胞株lncap总rna逆转录后的cdna，阴性质控品为正常前列腺上皮细胞株rwpe-1总rna逆转录后的cdna。

本发明所达到的有益效果：

本发明给出了一种基于pcr方法的dlx1/hoxc6尿液检测试剂盒，该试剂盒操作流程简便，耗时短，质控方法简便、结果重复性好。且使用该试剂盒用于前列腺癌早期诊断、尤其是对于高分级的前列腺癌，和临床病理结果具有非常良好的符合率。

附图说明

图1是实施例中标准品扩增曲线图；

图2是实施例中标准曲线图；

图3是dlx1检测roc曲线图；

图4是hoxc6检测roc曲线图；

图5是dlx1+hoxc6检测roc曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

一种dlx1和hoxc6在制备前列腺癌标志物中的试剂盒，包括dlx1mrna、和hoxc6mrna的定量检测试剂；所述dlx1mrna定量检测试剂包括seqidno.7和seqidno.8所示的检测引物和核苷酸序列如seqidno.9所示的探针；所述hoxc6mrna定量检测试剂包括如seqidno.10和seqidno.11所示的检测引物和核苷酸序列如seqidno.12所示的探针。

由于psa是前列腺特异抗原，尿液中的psa基因表达均来源于前列腺，因此尿液中psa基因(seqidno.3)可以用来作为前列腺来源rna量的内参基因。试剂盒还包括psamrna定量检测试剂，所述psamrna定量检测试剂包括如seqidno.13和seqidno.14所示的检测引物和核苷酸序列如seqidno.15所示的探针。

试剂盒还包括一步法rt-pcr反应液，一步法rt-pcr预混液包含one-steprt/rienzymemix，probeqpcrsupermix，反应条件为：逆转录50℃，25分钟为预变性95℃，3分钟，扩增95℃，10秒，60℃，30秒，45个循环。

试剂盒还包括标准品，阴性质控品和阳性质控品。标准品包括如seqidno.4所示的dlx1基因重组质粒、如seqidno.5所示的hoxc6基因重组质粒、如seqidno.6所示的psa基因重组质粒；阳性质控品为前列腺癌细胞株lncap总rna逆转录后的cdna，阴性质控品为正常前列腺上皮细胞株rwpe-1总rna逆转录后的cdna。

实施例1：用于对dlx1和hoxc6及参考基因psa定量pcr检测的引物及探针的设计与筛选

根据dlx1，hoxc6和psacdna序列(seqidno.1-seqidno.3)共设计了10组正向引物、反向引物及荧光探针，采用上述引物和探针，以dlx1，hoxc6和psamrna序列制备的重组质粒(seqidno.4-seqidno.6)为模板进行pcr扩增，并对扩增产物进行测序分析，验证所设计的10组引物及探针的可靠性，淘汰扩增效率低及扩增产物不特异的引物及探针。

经过初筛，保留6组正向引物、反向引物及荧光探针。然后提取尿液样本总rna反转录为cdna，分别使用上述初筛后的6组正向引物、反向引物及荧光探针进行pcr扩增，pcr扩增条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，60℃退火/延伸30秒，45个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测，根据ct值最小和荧光信号增幅最大原则进行筛选。经过上述试验过程，筛选优化得到的正向引物、反向引物及探针序列(seqidno.7-seqidno.15)

实施例2：dlx和hoxc6联合检测试剂盒反应体系和反应条件的优化1.反应体系的优化

1.1引物及探针浓度的优化

将正向引物(10μμ)、反向引物(10μμ)按体积比1:1混合，依次加入0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.8μl和1.0μl；探针(10μμ)依次加入0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl和0.7μl；再加入模板cdna2μl(100-300ng/μl)，2*probeqpcrsupermix15μl，ddh2o补足至30μl；同时对引物及探针浓度进行优化，根据最大荧光信号强度和最小ct值综合考虑，确定本发明的最佳引物用量为：正向引物和反向引物均为0.5μl，探针用量为0.5μl；正向引物、反向引物和探针的终浓度均为0.17μμ。

1.2实时定量pcr反应预混液的选择

为比较不同厂家生产的荧光定量反应预混液性能差异，使用相同的cdna模板，选取多种实时定量pcr反应预混液进行平行对比。pcr反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，60℃退火/延伸30秒，45个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

结果显示：使用2*probeqpcrsupermix作为荧光定量反应的预混液，具有最优的效果，因此，选用2*probeqpcrsupermix为荧光定量反应的预混液。

2.反应条件的优化

2.1退火温度的优化

根据引物tm值，将退火温度按58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、依次递增，进行退火温度的优化，选择最佳退火温度进行后续试验。

综合平衡退火温度pcr扩增反应的效率和扩增的特异性，优选的最佳退火温度为60℃。2.2退火时间的优化

在退火温度为60℃的条件下，设定退火时间分别为30s、31s、32s、33s、34s、对退火时间进行优化，经过实验对比，最终确定的最佳退火时间为33秒。

实施例3：检测试剂盒对于标准样品的灵敏度检测

根据(seqidno.4-seqidno.6)设计dlx1、hoxc6、psacdna重组质粒分别作梯度稀释，各有6个稀释点，分别浓度为100,000拷贝/微升、10,000拷贝/微升、1,000拷贝/微升、100拷贝/微升、10拷贝/微升、1拷贝/微升。

使用实施实例1获取的引物探针和实施实例2的反应条件进行pcr检测，反应条件为：95℃，3分钟；95℃，10秒，60℃，30秒，45个循环。扩增曲线如图1所示，然后根据检测结果绘制标准曲线，结果如图2所示。结果显示，这个由dxl1，hoxc6和psa组成的三重rt-pcr具有很高的灵敏度。

实施例4：临床样本的检测

采用本发明实施例3的荧光定量pcr检测试剂盒对62例临床标本(从浙江大学医学院附属第一医院泌尿外科获取的尿液样本，其中29例为前列腺癌(gleason>7的样本由23例)，，33例为前列腺炎或其他良性病变)进行检测。反应条件为：逆转录50℃15分钟，预变性95℃，3分钟；95℃，10秒，60℃，30秒，45个循环。根据标准样品分别计算每个样本dlx1，hoxc6和psa的拷贝数。然后使用dlx拷贝数/psa拷贝数计算dlx分数，hoxc6拷贝数/psa拷贝数计算hoxc6分数，将dlx分数和psa分数相加计算总分。分别使用dlx分数，hoxc6分数和总分和病理结果绘制受试者工作曲线(roc)评估三种分数对前列腺癌的诊断能力(图3-图5)，结果显示，dlx，hoxc6和dlx/hoxc6联合检测的auc分别是0.62，0.65，0.733，dlx/hoxc6联合检测具有显著优势，当评分阈值选在0.25时灵敏度为91％，特异性43％(对高分级前列腺癌特异性为61％)。

实施例5：本试剂盒还可以使用两步法rt-pcr试剂：由引物探针混合液，rt反应液和pcr反应液组成反应体系中rt反应液包括5×buffer，dntp，hiscriptiiireversetranscriptase，随机引物，oligo(dt)和水。pcr反应液包括2×buffer，dntp，mg2+，acetaqdnapolymerase和水。逆转录条件为：37℃，25分钟；85℃15秒；pcr条件为预变性95℃，10分钟，扩增95℃，10秒，60℃，30秒，45个循环。

综上，本发明的一种dlx1和hoxc6基因表达联合检测试剂盒及应用，其能够联合检测前列腺相关基因表达，可以明显地提高肿瘤的检出率，其设计巧妙，使用方便，适于大规模推广应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>杭州昱鼎生物科技有限公司

<120>dlx1和hoxc6在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒

<141>2019-11-12

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2203

<212>dna

<213>人类(homosapiens)

<400>1

aagctttgaaccgagtttggggagctcagcagcatcatgcttagacttttcaaagagaca60

aactccattttcttatgaatggaaagtgaaaacccctgttccgcttaaattgggttcctt120

cctgtcctgagaaacatagagacccccaaaagggaagcagaggagagaaagtcccacacc180

cagaccccgcgagaagagatgaccatgaccaccatgccagaaagtctcaacagccccgtg240

tcgggcaaggcggtgtttatggagtttgggccgcccaaccagcaaatgtctccttctccc300

atgtcccacgggcactactccatgcactgtttacactcggcgggccattcgcagcccgac360

ggcgcctacagctcagcctcgtccttctcccgaccgctgggctacccctacgtcaactcg420

gtcagcagccacgcatccagcccctacatcagttcggtgcagtcctacccgggcagcgcc480

agcctcgcccagagccgcctggaggacccaggtcaagatctggttccaaaacaagcgatc540

caagttcaagaagctgatgaagcagggtggggcggctctggagggtagtgcgttggccaa600

cggtcgggccctgtctgctggctccccacccgtgccgcccggctggaaccctaactcttc660

atccgggaagggctcaggaggaaacgcgggctcctatatccccagctacacatcgtggta720

cccttcagcgcaccaagaagctatgcagcaaccccaacttatgtgaggttgcccgcccgt780

ctccttcttgtctccccggcccaggtccctcccgcctccaggtccatccatcccgtccgg840

aaaagaaggacccagagggaagaaggaacagtggaggcgggacgccctccatctcctcgg900

agccccgcgaggtccggcccagcaacttcccggcatccgcgctctagcctgaaccctggc960

ctgggccgagcagtggcagcagagagtggcctcggagggaagccactgccacctgagaca1020

gcccaagcagcaagataaacccgctccacccgacccgccgaccttcagctttgtgggact1080

atcaggaaaaaacaaaacaaaaacaaaatgtagaaaaagcaaaagctcttttctgtcctg1140

tcagtctcctgtctccttttgctctgtctgtgcgctggtaaagtccaggtcctcatccgt1200

ccgctgtcctcattctgcggcctcagcaaaaagccacaaggtctgagcggcccgggtcct1260

gccgggctgaccatctccggatcctgggacactctgcctgaccatctgtgtagctggtgt1320

gggaatctgggggcattggagggagggggttttatttattgagaaatggacttcgcctga1380

ggctgtttgccaattcagggttctgctgggcgcaaggaacgcactgttcaaacgcactgt1440

ttactttaagcgcacggggagaaacgaataaggaggacgtggtgatttttaatttataca1500

gtaacttttgtacttctctggtatggagagtttggagccgaatgatttgcattttttaca1560

tgtccgacattatttaataaataatttttaaaagaaaagaacgataaatgaagccaacat1620

gattttctcatttcgggaggaactctgttgcttcgcctggacaagaaggaaaatgctgat1680

ttcctccttgggtagaaagagggagcgagggcaaatggggagtagagagaaaacaggcga1740

gaacaagcactctaattccagtgggctttaaaataagacaaaatcagctttacaacaatc1800

cctagaggctcgaccacagaataatgccagtcaccaccctgaacgcacaatctccagtgc1860

aggatctaatgactgtacatattattgttattattattattgttattattgttgttctgt1920

aaacatgttgcacaagcttagcctttttgcgttctgttgtgtgtggctgtaaaaccccat1980

gctttgtgaaatgagaatcttgacatttttcttgtgaaatttggaaaatgtgatcaattg2040

aaatcaactgtgttttgtgttctctatgtcaaagtttagttttatattgagaatgttaac2100

ttattgctttgtatcttgggaaaaaaactttgtaaataagttataaagtttctttgagac2160

agtaaaattatgatttcttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2203

<210>2

<211>1660

<212>dna

<213>人类(homosapiens)

<400>2

ataaccatctagttccgagtacaaactggagacagaaataaatattaaagaaatcataga60

ccgaccaggtaaaggcaaagggatgaattcctacttcactaacccttccttatcctgcca120

cctcgccgggggccaggacgtcctccccaacgtcgccctcaattccaccgcctatgatcc180

agtgaggcatttctcgacctatggagcggccgttgcccagaaccggatctactcgactcc240

cttttattcgccacaggagaatgtcgtgttcagttccagccgggggccgtatgactatgg300

atctaattccttttaccaggagaaagacatgctctcaaactgcagacaaaacaccttagg360

acataacacacagacctcaatcgctcaggattttagttctgagcagggcaggactgcgcc420

ccaggaccagaaagccagtatccagatttacccctggatgcagcgaatgaattcgcacag480

tggggtcggctacggagcggaccggaggcgcggccgccagatctactcgcggtaccagac540

cctggaactggagaaggaatttcacttcaatcgctacctaacgcggcgccggcgcatcga600

gatcgccaacgcgctttgcctgaccgagcgacagatcaaaatctggttccagaaccgccg660

gatgaagtggaaaaaagaatctaatctcacatccactctctcggggggcggcggaggggc720

caccgccgacagcctgggcggaaaagaggaaaagcgggaagagacagaagaggagaagca780

gaaagagtgaccaggactgtccctgccacccctctctccctttctccctcgctccccacc840

aactctcccctaatcacacactctgtatttatcactggcacaattgatgtgttttgattc900

cctaaaacaaaattagggagtcaaacgtggacctgaaagtcagctctggaccccctccct960

caccgcacaactctctttcaccacgcgcctcctcctcctcgctcccttgctagctcgttc1020

tcggcttgtctacaggcccttttccccgtccaggccttgggggctcggaccctgaactca1080

gactctacagattgccctccaagtgaggacttggctcccccactccttcgacgcccccac1140

ccccgccccccgtgcagagagccggctcctgggcctgctggggcctctgctccagggcct1200

cagggcccggcctggcagccggggagggccggaggcccaaggagggcgcgccttggcccc1260

acaccaacccccagggcctccccgcagtccctgcctagcccctctgccccagcaaatgcc1320

cagcccaggcaaattgtatttaaagaatcctgggggtcattatggcattttacaaactgt1380

gaccgtttctgtgtgaagatttttagctgtatttgtggtctctgtatttatatttatgtt1440

tagcaccgtcagtgttcctatccaatttcaaaaaaggaaaaaaaagagggaaaattacaa1500

aaagagagaaaaaaagtgaatgacgtttgtttagccagtaggagaaaataaataaataaa1560

taaatcccttcgtgttaccctcctgtataaatccaacctctgggtccgttctcgaatatt1620

taataaaactgatattatttttaaaactttaaaaaaaaaa1660

<210>3

<211>1483

<212>dna

<213>人类(homosapiens)

<400>3

agccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtct60

tcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatcctgtctcggattgtgg120

gaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggca180

gggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgca240

tcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacag300

gccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctga360

agaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgt420

cagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccag480

cactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttga540

ccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaag600

ttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaa660

gcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatca720

cgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtgg780

tgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctatcaa840

ccccctattgtagtaaacttggaaccttggaaatgaccaggccaagactcaagcctcccc900

agttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctaggaaaagaaatcagc960

agacacaggtgtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgtcctctctgtgtcct1020

ggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaatttctctgaggacacagatagga1080

tggggtgtctgtgttatttgtggggtacagagatgaaagaggggtgggatccacactgag1140

agagtggagagtgacatgtgctggacactgtccatgaagcactgagcagaagctggaggc1200

acaacgcaccagacactcacagcaaggatggagctgaaaacataacccactctgtcctgg1260

aggcactgggaagcctagagaaggctgtgagccaaggagggagggtcttcctttggcatg1320

ggatggggatgaagtaaggagagggactggaccccctggaagctgattcactatgggggg1380

aggtgtattgaagtcctccagacaaccctcagatttgatgatttcctagtagaactcaca1440

gaaataaagagctgttatactgtgaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1483

<210>4

<211>173

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gagggaagaaggaacagtggaggcgggacgccctccatctcctcggagccccgcgaggtc60

cggcccagcaacttcccggcatccgcgctctagcctgaaccctggcctgggccgagcagt120

ggcagcagagagtggcctcggagggaagccactgccacctgagacagcccaag173

<210>5

<211>222

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gttccagaaccgccggatgaagtggaaaaaagaatctaatctcacatccactctctcggg60

gggcggcggaggggccaccgccgacagcctgggcggaaaagaggaaaagcgggaagagac120

agaagaggagaagcagaaagagtgaccaggactgtccctgccacccctctctccctttct180

ccctcgctccccaccaactctcccctaatcacacactctgta222

<210>6

<211>136

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcagga60

acaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccagg120

tatttcaggtcagcca136

<210>7

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gagggaagaaggaaca16

<210>8

<211>15

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

cttgggctgtctcag15

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

cggcatccgcgctctagcct20

<210>10

<211>14

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

gttccagaaccgcc14

<210>11

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

tacagagtgtgtgattagg19

<210>12

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

gggccaccgccgacagcc18

<210>13

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

tctgcggcggtgttct16

<210>14

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

tggctgacctgaaata16

<210>15

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

gcccactgcatcaggaaca19