一种用于培养和分离切削液中微生物的培养基及其制备方法和应用与流程

本发明属于微生物领域，涉及一种培养基，具体涉及一种用于培养和分离切削液中微生物的培养基及其制备方法和应用。

背景技术：

水溶性切削液是一种水包油的乳化相，极易滋生微生物和真菌。微生物在海洋、石油管道、核电等领域造成的腐蚀损失已经引起了广泛关注，而在切削加工行业，切削乳化液中滋生的微生物对工件、刀具以及机床的腐蚀影响不容小觑。铝合金零件在碱性切削乳化液中加工时，极易出现白斑黑点等微生物腐蚀现象，微生物同时会导致切削液润滑性及冷却性下降，劣化切削液，加速铝合金腐蚀。而且铝合金价格贵，铝合金零件周转周期长，精度要求高，尤其是在航空航天工业，一旦受微生物及切削乳化液劣化影响出现腐蚀，只能报废，给企业造成巨大的经济损失。另外，微生物新陈代谢活动会导致切削乳化液的性能下降，金属加工液一旦失效，这些添加物永远不能重新构成原始状态的工作液。最终，切削乳化液劣化变质，性能降低，并过早地成为废液，增加企业的成本，而废弃的切削乳化废液直接排放会对环境和人类健康造成危害。

目前的研究普遍认为铝合金腐蚀现象是由切削液的劣化造成的和微生物腐蚀共同造成，而切削液的劣化正是由于微生物的繁殖及生长所造成。产生腐蚀的根本原因及机制的研究是解决铝合金切削过程中腐蚀问题的基础。为了深入研究产生腐蚀的根本原因及腐蚀机制，找出其中哪些微生物会造成腐蚀，破坏切削液，开发出效果良好的抑菌剂，抑制切削液劣化和微生物腐蚀，就需要进行微生物的培养与分离。现有培养基无法满足切削液中特有微生物的生长，导致用于进行培养与分离；因此需要开发一种以切削液主要成分为营养物质，同时辅以常见营养元素，可为切削液中常见和特有微生物提供了良好的营养物质基础的特殊培养基。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种可用于培养和分离切削液微生物的培养基，具有方便快捷，价格便宜等优点，能够同时培养与分离切削液中大多数的微生物。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于培养和分离切削液中微生物的培养基，所述培养基包括以下组分：牛肉膏、蛋白胨、三乙醇胺硼酸酯及其衍生物、油酸，甲醇、有机磷酸酯及其衍生物和蒸馏水。

牛肉膏和蛋白胨为常用微生物培养的营养物质，牛肉膏为微生物提供必要的碳源、磷酸盐和维生素，蛋白胨为微生物提供必要的碳源、氮源和生长因子；三乙醇胺硼酸酯及其衍生物为含氮脂肪族化合物，其可以为微生物提供必要的碳源、氮源，以及维持培养基的ph值稳定；油酸为一种不饱和脂肪酸，常见于植物体内，其可以为微生物提供氮源，同时有利于培养基长期存放，防止培养基被氧化；甲醇为饱和一元醇可以被微生物利用，为微生物提供碳源，合成蛋白质；机磷酸酯及其衍生物为含氮、磷的脂肪族化合物，其可以为微生物提供碳源、氮源、磷源。

现有的培养基与切削液的成分有很大的差别，本发明根据切削液的成分，探索并最终设计了适用于培养和分离切削液中微生物的培养基，以三乙醇胺硼酸酯、油酸，甲醇、有机磷酸酯作为主要营养物质，辅以牛肉膏、蛋白胨等常用营养物质，可为切削液中的微生物提供良好营养环境。

作为本发明的优选实施方式，所述培养基的ph值为8.3～8.5。

ph值为影响微生物培养的另一个主要因素，本发明根据切削液的性质，将ph值调整为8.3～8.5，可进一步为目标微生物提供良好的酸碱环境，并减少杂菌的产生。

作为本发明的优选实施方式，所述培养基包括以下组分：牛肉膏2～8g/l、蛋白胨2～8g/l、三乙醇胺硼酸酯及其衍生物40～120g/l、油酸3～8g/l，甲醇1～5g/l、有机磷酸酯及其衍生物1～5g/l和蒸馏水。

本发明对培养基的各成分进行了优化，在该配比条件下，能够快速分离得到切削液的微生物，效果更好，价格便宜。

作为本发明的优选实施方式，所述培养基由以下组分组成：牛肉膏5g，蛋白胨5g，三乙醇胺硼酸酯及其衍生物80g，油酸5.5g，甲醇3g，有机磷酸酯及其衍生物3g，蒸馏水1000ml。

作为本发明的优选实施方式，所述的三乙醇胺硼酸酯及其衍生物选自一乙醇胺硼酸酯、二乙醇胺硼酸酯、三乙醇胺硼酸酯中的至少一种。

一乙醇胺硼酸酯、二乙醇胺硼酸酯、三乙醇胺硼酸酯易被微生物分解利用。

作为本发明的优选实施方式，所述的有机磷酸酯及其衍生物选自有机磷酸三乙酯、有机磷酸三丙酯、有机磷酸二乙酯中的至少一种。

有机磷酸三乙酯、有机磷酸三丙酯、有机磷酸二乙酯易被微生物分解利用。

进一步地，所述培养基还包括琼脂。

可将本发明的培养基通过加入一定量的琼脂，制备成固态的培养基。

优选地，所述培养基含有10～15g/l琼脂。

本发明还提供所述培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将三乙醇胺硼酸酯、油酸、甲醇、有机磷酸酯、牛肉膏、蛋白胨以及琼脂按顺序加入蒸馏水中，混合均匀，调节ph值，加热灭菌。

该制备方法能够充分将各组分溶于水中，不易产生不溶于水的物质，利于各成分的充分利用。

制备液体培养基时，不需要添加琼脂，灭菌后降至室温即可用于微生物培养和分离；制备固体培养基时需要加入琼脂，灭菌后分装至平板中，待冷却后形成固体平板后进一步用于微生物的培养和分离。

进一步地，所述灭菌过程为121℃加热15min。

培养基通常含有丰富的营养，制备过程中可能引入各种微生物，快速高温灭菌可杀灭杂菌而减少对营养成分的破坏。

本发明所述培养基可用于培养和分离切削液中的微生物。

本发明所述培养基根据切削液的成分进行特殊配比，特别适用于培养和分离切削液中的微生物。

本发明还提供利用所述培养基培养和分离切削液中微生物的方法，包括以下步骤：取切削液样本，加入如所述培养基中，30～37℃培养24～48h。

所述切削液样本可为直接从加工场所取得的产生了一定腐败的切削液(新鲜切削液呈乳白色，该切削液一般呈乳黄色)，或经一定浓度稀释的腐败切削液。进行微生物培养和分离时，按一般微生物的培养和分离步骤操作即可。

进一步地，当所述培养基为液体培养基时需要在摇床中进行振荡培养，转速为80～120r/min。

使用液体培养基培养时，需使用摇床进行振荡以提高培养效果。

本发明公开的切削液微生物的分离培养基解决了现有培养基不能培养与分离切削液中微生物，或者培养与分离效果较差的问题；培养基的配制和使用方法方便快捷，培养基的成本低廉、分离培养效果良好，特别适用于快速培养和分离切削液中的微生物，为进一步开发出效果良好的抑菌剂，抑制切削液劣化和微生物腐蚀打下基础。

附图说明

图1倒置荧光显微镜下观察溶液中细菌的密度。

图2纯化后的切削液菌种生长曲线。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明一种用于分离培养切削液中微生物的培养基的实施例，所述培养基由以下组分组成：牛肉膏2g，蛋白胨2g，三乙醇胺硼酸酯及其衍生物40g，油酸3g，甲醇1g，有机磷酸酯及其衍生物1g，蒸馏水1000ml；所述的三乙醇胺硼酸酯及其衍生物为三乙醇胺硼酸酯；所述的有机磷酸酯及其衍生物为有机磷酸三乙酯。

实施例2

本发明一种用于分离培养切削液中微生物的培养基的实施例，所述培养基由以下组分组成：牛肉膏8g，蛋白胨8g，三乙醇胺硼酸酯及其衍生物120g，油酸8g，甲醇5g，有机磷酸酯及其衍生物5g，蒸馏水1000ml；所述的三乙醇胺硼酸酯及其衍生物为一乙醇胺硼酸酯；所述的有机磷酸酯及其衍生物为有机磷酸二乙酯。

实施例3

本发明一种用于分离培养切削液中微生物的培养基的实施例，所述培养基由以下组分组成：牛肉膏3.5g，蛋白胨3.5g，三乙醇胺硼酸酯及其衍生物60g，油酸4g，甲醇2g，有机磷酸酯及其衍生物2g，蒸馏水1000ml；所述的三乙醇胺硼酸酯及其衍生物为二乙醇胺硼酸酯；所述的有机磷酸酯及其衍生物为有机磷酸三丙酯。

实施例4

本发明一种用于分离培养切削液中微生物的培养基的实施例，所述培养基由以下组分组成：牛肉膏6.5g，蛋白胨6.5g，三乙醇胺硼酸酯及其衍生物100g，油酸7g，甲醇4g，有机磷酸酯及其衍生物4g，蒸馏水1000ml；所述的三乙醇胺硼酸酯及其衍生物为三乙醇胺硼酸酯；所述的有机磷酸酯及其衍生物为有机磷酸三乙酯。

实施例5

本发明一种用于分离培养切削液中微生物的培养基的实施例，所述培养基由以下组分组成：牛肉膏5g，蛋白胨5g，三乙醇胺硼酸酯及其衍生物80g，油酸5.5g，甲醇3g，有机磷酸酯及其衍生物3g，蒸馏水1000ml；所述的三乙醇胺硼酸酯及其衍生物为三乙醇胺硼酸酯；所述的有机磷酸酯及其衍生物为有机磷酸三乙酯。

对比例1

本发明一种用于分离培养切削液中微生物的培养基的对比例，所述培养基除以下组分外，其余组分与实施例5相同：牛肉膏0.5g。

对比例2

本发明一种用于分离培养切削液中微生物的培养基的对比例，所述培养基除以下组分外，其余组分与实施例5相同：蛋白胨0.5g。

对比例3

本发明一种用于分离培养切削液中微生物的培养基的对比例，所述培养基除以下组分外，其余组分与实施例5相同：三乙醇胺硼酸酯及其衍生物10g。

对比例4

本发明一种用于分离培养切削液中微生物的培养基的对比例，所述培养基除以下组分外，其余组分与实施例5相同：油酸0.5g。

对比例5

本发明一种用于分离培养切削液中微生物的培养基的对比例，所述培养基除以下组分外，其余组分与实施例5相同：甲醇0.3g。

对比例6

本发明一种用于分离培养切削液中微生物的培养基的对比例，所述培养基除以下组分外，其余组分与实施例5相同：有机磷酸酯及其衍生物0.3g。

一、分离效果

从上海汽车零部件加工车间取得切削液，温度为30℃，ph值为8.3，该切削液呈现乳黄色，与新鲜切削液的乳白色呈现明显不同。

实施例及对比例的培养基制备过程中，溶剂添加顺序为三乙醇胺硼酸酯及其衍生物、油酸、甲醇、有机磷酸酯及其衍生物、牛肉膏、蛋白胨，混合均匀后调至ph为8.3；2216e与lb培养基同样调节ph为8.3，在121℃条件下加热15min灭菌处理后，放至室温待用。

各实施例、对比例及2216e与lb培养基对应的固体培养基添加10～15g/l琼脂，灭菌处理后，倾注固体培养基平板待用。

取1ml废切削液进行1：10的倍比稀释，5稀释梯度，进行稀释。取最后一个稀释梯度溶液100μl分别在各实施例固体培养基、对比例液体培养基、2216e固体培养基、lb固体培养基上涂布，最后放进生化培养箱在30～37℃条件下培养24～48h，之后进行细菌纯化三次，最后将所得到的菌株进行16srdna鉴定，统计所得菌株数目。

与此同时向各实施例、对比例液体培养基、2216e液体培养基及lb液体培养基中加入100μl取回来的切削液样本，放再摇床上在30～37℃、80～120r/min条件下培养24～48h，连同废切削液送去生物公司进行微生物多样性测试，确定各自所含菌属总数目，并计算液体培养基培养出来的微生物菌属数占切削液菌属总数的比率。结果如表1。

表1各培养基的分离效果

本发明公开的一种用于培养和分离切削液中微生物的培养基中细菌效果良好，实施例5中所能培养的细菌菌属数占到微生物菌属总数的76.5％，分离鉴定出的菌株数为16株，远超其它常见培养基。

二、培养效果

向实施例5中的液体培养基、2216e液体培养基、lb液体培养基中加入100μl取回来的切削液样本，放再摇床上在30～37℃、80～120r/min条件下培养24～48h，之后加入吖啶橙染色10～15min，取100～200μl滴加在铝合金板上，在倒置荧光显微镜下观察溶液中细菌的浓度/密度；实验结果如图1(a.切削液；b.实施例5培养基；c.2216e培养基；d.lb培养基)。

以现场采集的切削液作为对比，实施例5液体培养基中微生物浓度与其相似，而常见的2216e、lb培养基中的细菌浓度均较低。说明本专利培养基适合培养切削液中的微生物，且在细菌总体浓度上与实际切削液基本相同。

三、生长状况

随机选取了三株从切削液中分离出的微生物，将其接种到实施例5的液体培养基中，通过紫外分光光度计在600nm条件下测量对应培养基od值，与空白的本专利培养基进行对比，绘制生长曲线，结果如图2(a.假单胞菌；b.芽孢杆菌；c.普罗维登斯菌)。

由结果可得，三株细菌生长状况良好，且能维持较长的时间，培养效果良好，进一步说明本发明培养基适用于培养和分离切削液中的微生物。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。