转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法与流程

本发明属于基因技术领域，具体涉及一种利用昆虫杆状病毒转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法。

背景技术：

cas9基因编辑方法具有使用方便，构建简单的特点，可以覆盖大多数区域的基因编辑需求。然而，该技术目前仍面临如下问题：当质粒较大时，转染的难度相对较大；具有碱基识别偏好性，局限了基因编辑的运用范围，而且会导致不同基因位点编辑效率不同；往往需要进行大量的筛选工作。因此，该技术的适用范围受到了一定的制约。

cas9基因长度为4101bp，且cas9蛋白需要进入细胞核才能发挥作用，因此需要增加核定位信号。通常质粒上还有带有原核及真核的筛选标记基因，加上grna表达框等原件，质粒总长度通常在9000bp以上。

现有的cas9传导方法中，通过脂质体、聚合物等常规化学试剂转染难度相对较大，虽然电转能在一定程度上解决转染困难的问题，但是对设备投入较大，不同的细胞电转条件不一样，优化摸索工作量较大。不论何种转染方式，通常对于细胞总数量和细胞密度都有一定的要求，转染完成后，要进行大量的细胞筛选，才能得到编辑的单克隆细胞。因为cas9蛋白非常大，慢病毒包装效率也非常困难，且由于慢病毒的整合特性，可能会造成cas9的恒定表达，增加脱靶的风险。无论是瞬时转染，电转，慢病毒包装，都存在较大的困难，效率极低，往往需要借助流式进行大量的筛选或者利用抗性基因进行筛选。

综上所述，现有技术亟需克服上述现有技术中cas9基因编辑技术中存在的缺点。

技术实现要素：

针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种适于大质粒转导的、通用于多种动物细胞的和操作简单的将cas9基因转导到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法。

为了实现上述目的，本申请提供了一种利用昆虫杆状病毒转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)向bacmid质粒中插入grna、cas9、筛选标记的基因片段、哺乳动物细胞可识别的启动子、转录终止子序列，构建得到重组bacmid质粒；

(2)将所得重组bacmid质粒转染sf9细胞，包装获得重组杆状病毒，收集含有病毒粒子的sf9细胞上清；

(3)将哺乳动物细胞以每孔不超过10个置于细胞培养板中，然后加入上述重组杆状病毒毒液，进行培养；

(4)将发生了转导的细胞进行稀释，挑取单克隆，确认基因编辑效果，获得编辑成功的单克隆细胞株。

申请号为201680010946.3的中国专利申请公布了一种向哺乳动物的受精卵导入编码cas9蛋白的mrna(cas9mrna)的方法。该专利之前，利用电穿孔对于大鼠受精卵进行cas9导入时，所得的基因编辑效率小于9％。该专利较好的实现了将cas9导入哺乳动物细胞的效果。不过，由于电穿孔对于设备的要求较高，并且在转染之后还需进行大量的筛选工作，总体的工作难度和效率仍然并不理想。

为了解决病毒载体的有限包装能力和递送效率低的问题，本领域人员还研究了双载体用于cas9的递送和表达。如韩国的基础科学研究院在其专利pct/kr2015/012503中公布了使用由两个载体表达的cas9蛋白质调节基因表达的方法，该专利通过了载体包装cas9蛋白质的限制，并且通过构建单独表达cas9蛋白质的两个经切割的结构域的重组载体以及递送待在细胞中表达的所构建重组载体而增加了cas9蛋白质的细胞内递送的效率。不过该方法在构建载体时，较为复杂，且大多数哺乳动物细胞即使是转染小质粒，转染效率也不高，该方法虽然可以在一定程度上克服cas9转染困难的问题，但是程度有限。

bacmid质粒为杆状病毒质粒，英文全称为baculovirusplasmid，其是带有杆状病毒基因组的质粒，可在细菌和昆虫细胞之间穿梭。昆虫杆状病毒是一类双链环状超螺旋dna病毒(dna分子长度为82～180kbp)，是一种公认的适用于表达大基因片段的工具。本发明发现，将带有grna、cas9、筛选标记的基因片段及哺乳动物细胞可识别的启动子(如cmv)和转录终止子序列，插入到杆状病毒bacmid质粒，构建重组bacmid质粒并转染入sf9细胞进行包装获得重组bacmid质粒之后，将重组质粒导入哺乳动物细胞，可以显著的提高转导效率。同时，本发明由于采用的是一种接近单细胞转导的方法，无需反复大量稀释筛选即可找到成功编辑的克隆，这相对于如中国专利201680010946.3等现有技术的方法而言，具有极大的便利性。

对于本领域技术人员而言，不难理解的是，被昆虫杆状病毒转导到哺乳细胞内的bacmid质粒dna含有完整的能在哺乳动物细胞内表达grna、cas9蛋白的原件。由于昆虫杆状病毒对于哺乳动物细胞完全没有毒性，因此可以将细胞稀释到极低密度(数个/孔)后进行转导操作，不仅转导效率高而且操作简单、成本低，并且后期无需进行大量的筛选。

如本发明的一个实施例所示，本发明在向哺乳动物细胞(293t细胞、hela细胞、hepg2细胞和mcf-7细胞)传导cas9时，效率高达80％以上，显示出优异的传导效率。同时，本发明适于多种哺乳动物细胞，显著的降低了cas9基因编辑的操作难度，扩大了其应用的范围。

另外，本领域技术人员容易理解的是，由于本发明采用的是杆状病毒，其易于保存、复制，可高效的进行重复利用，便于相关工作的开展。

作为本发明的一个优先的实施方案，步骤(1)中，还向bacmid质粒中插入昆虫细胞能识别的启动子和带有有跨膜肽的vsv-g蛋白基因。vsv-g是源于水泡性口炎病毒的融合性外壳g糖蛋白，vsv-g蛋白基因的插入，使得vsv-g蛋白能表达到杆状病毒表面，提高杆状病毒转导效率也更广泛的应用于不同的细胞。

作为本发明一个可选的实施方案，所述哺乳动物细胞可识别的启动子包括actin启动子或者cmv启动子；和/或，所述昆虫细胞能识别的启动子包括polyhedrin启动子或p10启动子。

在本发明中，所用的启动子不限于u6启动子、cmv启动子和actin启动子。只要能在哺乳动物细胞内能发挥作用的以及属于ires(internalribosomeentrysite)的均可。

在本发明中，作为可选的技术方案，所述哺乳动物细胞可选自293t细胞、hela细胞、hepg2细胞或mcf-7细胞。但适于本发明的哺乳动物细胞不限于上述几种，适用的细胞还包括但不限于下述网址记载的细胞：

https：//www.sigmaaldrich.com/china-mainland/zh/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna/learning-center/lentivirus-cell-line.html

作为本发明的一个可选的技术方案，所述重组bacmid质粒的制备方法优选但不限于bactobac，方法如下：

向pfastbac1载体ph启动子后面插入带有跨膜肽的vsv-g蛋白基因；在pfastbac1载体的庆大霉素(英文名：gentamicin)序列片段与polyherdri启动子原件之间插入u6启动子，grnascaffold、poliii终止子，cmv-cas9、筛选标记片段(egfp)和bghpoly(a)原件；在u6启动子与grnascaffold序列之间插入grna靶序列，构建穿梭质粒；然后将穿梭质粒转化至大肠杆菌中，筛选获得重组bacmid。

作为本发明可选的技术方案，在制备重组bacmid质粒时，所述所述筛选标记片段包括egfp、mcherry、zeocin、潮霉素或者新霉素基因序列片段，优选egfp、mcherry等可视化标签；所述大肠杆菌为dh10bac菌株。

作为本发明优选的技术方案，步骤(3)中，加入所述重组杆状病毒毒液之后，先培养48-72h，然后换新鲜培养基

作为本发明优选的技术方案，所述方法在步骤(4)之后还包括步骤：感染48到72h后，稀释成单克隆，继续培养细胞增殖到足够量以便于基因编辑效果分析；将发生了转导的孔的细胞稀释，挑取单克隆，进一步确认基因编辑效果。具体的，在进行上述步骤时，通过观察egp或者mcherry荧光，确定转导效率，可将发生了转导的孔的细胞稀释至96孔板(0.5细胞/孔)，标记成功转导的单克隆，继续培养，待细胞增殖到足量，进一步确认基因编辑效果并挑选最佳的编辑成功的单克隆细胞株。

本发明的有益效果：

本发明的方法对于cas9的传导效率优异，可将大dna导入哺乳动物细胞，降低大的dna导入哺乳动物细胞的难度；本发明接近单细胞转导的方法，无需反复大量稀释筛选即可找到成功编辑的克隆；本发明所用杆状病毒，易于保存、复制，可高效重复利用，便于相关工作的开展。

附图说明

图1和图2为本发明一个实施例采用的质粒的基本元件的示意图；

图3为pfastbac1载体的示意图；

图4为本发明实施例1构建的完整质粒载体图谱；

图5为tp53对照样本sanger测序图；

图6为tp53基因敲除样本sanger测序阳性图(插入单碱基t)；

图7为tp53基因敲除wb实验结果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1.1原料

pfastbac1载体(如图3所示)、vsv-g基因、u6启动子、cas9蛋白基因、庆大霉素基因、poly(a)、grna靶序列、大肠杆菌dh10bac、质粒抽提试剂盒、293t细胞、hela细胞、hepg2细胞和mcf-7细胞、sf9细胞、细胞培养基、96孔板。

上述单元的基因序列见序列表信息，其中seqidno.1是所构建的完整的载体序列信息；seqidno.2是cas9-egfp序列信息；seqidno.3是u6启动子+mcs+grnascanfold+poliii终止子序列信息；seqidno.4是cmvenhancer+cmv启动子序列信息；seqidno.5是bghpoly(a)序列信息；seqidno.6是vsv-g序列信息。

1.2构建方法

(1)在pfastbac1载体的ph启动子后面插入带有跨膜肽的vsv-g基因；

(2)在庆大霉素(gentamicin)与polyherdrin启动子原件之间插入u6启动子、cas9蛋白基因、egfp和poly(a)原件。在u6启动子与grnascaffold序列之间带有多克隆位点，用于插入grna靶序列；

(3)向上述改造好的载体上插入grna靶序列，构建好穿梭质粒；

(4)将穿梭质粒转化大肠杆菌dh10bac，筛选获得重组bacmid质粒；

(5)提取bacmid质粒并转染sf9细胞，包装获得重组杆状病毒，收集含有病毒粒子的sf9细胞上清；

(6)将状态良好的293t细胞、hela细胞、hepg2细胞和mcf-7细胞分别稀释到96孔板，每孔1～10个细胞；24h后，往每孔细胞中加入杆状杆状病毒毒液，培养48-72h后换新鲜培养基。

(7)观察荧光细胞比例，以及亮度，发出荧光的细胞即为bacmid成功转导的细胞，选择转导效率最高的孔的细胞稀释至96孔板(0.5细胞/孔)，继续培养到足量细胞，进一步确认基因编辑效果，获得编辑成功的单克隆细胞株。通过测试，转导效率均达到80％以上。

1.3检测方法

a.基因组dna提取→pcr→sanger测序

b.wb，ihc等检测方法

1.4基因敲除实例

tp53基因敲除

目的外显子序列-外显子3：

tcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccccgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccagaaaacctaccagggcagctacggtttccgtctg靶点序列：ggatgatttgatgctgtcccngg

穿梭质粒构建引物：

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基因组pcr扩增引物：

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tp53-r：5agaaatgcagggggatacgg

基因组dnapcr产物序列：

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还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>武汉华美生物工程有限公司

<120>转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>12489

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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