一种抗4-1BB的人源化抗体的用途的制作方法

一种抗4-1bb的人源化抗体的用途
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抗4-1bb的人源化抗体的用途。


背景技术：

2.4-1bb，也称作cd137、tnfrsf9等，是肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrs)的一种跨膜蛋白，其是由kwon和weissman在激活的鼠t细胞克隆分化筛选过程中首先发现的。schwarzh等从人活化t细胞中分离出与鼠4-1bb具有同源性的人4-1bb(hu4-1bb),并将其命名为cd137。4-1bb是ⅰ型膜糖蛋白，不同于pd-1/pd-l，4-1bb的表达具有激活依赖性，其介导t细胞活化的共刺激信号，广泛存在于免疫细胞包括激活的nk细胞、活化的t细胞、树突状细胞(dc)、肥大细胞、单核细胞、中性粒细胞表面。人4-1bb由255个氨基酸残基组成，以单体和二聚体形式表达在细胞表面，并且易于与配体形成三聚体，进而开启信号转导。
3.研究表明，4-1bb介导的共刺激信号可增强t细胞的功能，提高t细胞对肿瘤细胞的监视和病毒感染的免疫防御作用。一些4-1bb激动剂抗体能够增加共刺激分子表达，并且显著增强t细胞免疫应答，引起抗肿瘤功效。利用配体4-1bbl或激活型4-1bb单抗激活4-1bb，可刺激t细胞和抗原提呈细胞增殖并分泌细胞因子，提高机体的抗肿瘤免疫应答水平。进一步地，4-1bb单一治疗和组合治疗肿瘤模型已经确定持久的抗肿瘤保护性t细胞记忆应答。与此同时，4-1bb激动剂在许多本领域认可的自身免疫模型中也已经显示抑制自身免疫反应。4-1bb信号途径可诱导体内cd4
+ t细胞介导的免疫耐受，阻止自身免疫性疾病的发生、发展。4-1bb这种双重活性提供了抗肿瘤活性，同时可减弱自身免疫副作用。
4.目前，并无关于4-1bb的激动剂药物上市，最快的还处在临床研发阶段，而且为数不多，不能满足各种疾病包括癌症的对于免疫治疗方法的需求。针对4-1bb靶点，研制一种“加速器”药物，利用现有的癌症药物(如罗氏的rituxan)帮助激活免疫系统，开发新型肿瘤免疫疗法，适应市场需求，避免pd-1/pd-l1的耐药劣势，具有很好的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种抗4-1bb的人源化抗体的用途。
6.第一方面，本发明要求保护抗体或其抗原结合片段或核酸分子或表达盒、重组载体或重组细胞或药物组合物在如下任一中的应用：
7.(a1)制备用于检测4-1bb的产品，或检测4-1bb。
8.在实际应用中，可将所述抗体或其抗原结合片段用作诊断工具检测癌症、自身免疫或其他疾病的患者的血液或组织中的4-1bb。
9.其中，所述4-1bb可为人4-1bb，也可为猴4-1bb。
10.(a2)制备用于阻断4-1bb/4-1bbl信号通路的产品，或阻断4-1bb/4-1bbl信号通路。
11.在本发明的具体实施方式中，所述4-1bb/4-1bbl信号通路具体为人4-1bb/4-1bbl信号通路。
12.(a3)制备用于刺激t细胞活化的产品，或刺激t细胞活化。
13.进一步地，所述t细胞活化依赖于fcγr||a和/或fcγr||b。
14.(a4)制备用于促进t细胞分泌ifn-γ的产品，或促进t细胞分泌ifn-γ。
15.(a5)制备用于抑制结肠癌细胞生长的产品，或抑制结肠癌细胞生长。
16.在本发明的具体实施方式中，所述结肠癌细胞具体为mc38细胞。
17.(a6)制备用于抑制结肠癌肿瘤生长的产品，或抑制结肠癌肿瘤生长。
18.在本发明的具体实施方式中，所述结肠癌肿瘤为由mc38细胞所致的结肠癌肿瘤。
19.(a7)制备用于治疗和/或预防结肠癌的产品，或治疗和/或预防结肠癌。
20.所述抗体的重链可变区中hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列依次如seq id no.1自n端起第31-35位、第50-64位、第98-106位所示；轻链可变区中lcdr1、lcdr2和lhcdr3的氨基酸序列依次如seq id no.2自n端起第24-34位、第50-56位、第89-97位所示。
21.所述核酸分子为编码所述抗体或所述抗原结合片段的核酸分子。
22.所述表达盒为含有所述核酸分子的表达盒。
23.所述重组载体为含有所述核酸分子的重组载体。
24.所述重组细胞为含有所述核酸分子的重组细胞。
25.所述药物组合物包含：(a1)所述抗体或所述抗原结合片段；(a2)药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
26.第二方面，本发明要求保护抗体或其抗原结合片段或或药物组合物在如下任一中的应用：
27.(b1)作为免疫增强物，或制备免疫增强物。
28.其中，所述免疫增强物可为或者抗肿瘤免疫反应的增强物或抗病毒免疫反应的免疫增强物。
29.(b2)作为免疫调节物，或制备免疫调节物。
30.其中，所述免疫调节物具体可为t细胞介导的自身免疫疾病的免疫调节物。
31.所述抗体的重链可变区中hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列依次如seq id no.1自n端起第31-35位、第50-64位、第98-106位所示；所述抗体的轻链可变区中lcdr1、lcdr2和lhcdr3的氨基酸序列依次如seq id no.2自n端起第24-34位、第50-56位、第89-97位所示。
32.所述核酸分子为编码所述抗体或所述抗原结合片段的核酸分子。
33.所述表达盒为含有所述核酸分子的表达盒。
34.所述重组载体为含有所述核酸分子的重组载体。
35.所述重组细胞为含有所述核酸分子的重组细胞。
36.所述药物组合物包含：(a1)所述抗体或所述抗原结合片段；(a2)药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
37.第三方面，本发明要求保护抗体或其抗原结合片段或核酸分子或表达盒、重组载体或重组细胞或药物组合物在如下任一中的应用：
38.(c1)制备用于治疗和/或预防和/或诊断具有4-1bb表达失调特征疾病的产品，或治疗和/或预防和/或诊断具有4-1bb表达失调特征疾病。
39.(c2)制备用于治疗和/或预防和/或诊断癌症的产品，或治疗和/或预防和/或诊断癌症。
40.进一步地，所述癌症可为4-1bb表达失调的癌症。
41.(c3)制备用于治疗和/或预防和/或诊断自身免疫疾病的产品，或治疗和/或预防和/或诊断自身免疫疾病。
42.进一步地，所述自身免疫疾病可为4-1bb表达失调的自身免疫疾病。
43.(c4)制备用于治疗和/或预防和/或诊断炎症疾病的产品，或治疗和/或预防和/或诊断炎症疾病。
44.进一步地，所述炎症疾病可为4-1bb表达失调的炎症疾病。
45.(c5)制备用于治疗和/或预防和/或诊断感染性疾病的产品，或治疗和/或预防和/或诊断感染性疾病。
46.进一步地，所述感染性疾病可为4-1bb表达失调的感染性疾病。
47.所述抗体的重链可变区中hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列依次如seq id no.1自n端起第31-35位、第50-64位、第98-106位所示；所述抗体的轻链可变区中lcdr1、lcdr2和lhcdr3的氨基酸序列依次如seq id no.2自n端起第24-34位、第50-56位、第89-97位所示。
48.所述核酸分子为编码所述抗体或所述抗原结合片段的核酸分子。
49.所述表达盒为含有所述核酸分子的表达盒。
50.所述重组载体为含有所述核酸分子的重组载体。
51.所述重组细胞为含有所述核酸分子的重组细胞。
52.所述药物组合物包含：(a1)所述抗体或所述抗原结合片段；(a2)药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
53.进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no.1自n端起第1-117位，或者与seq id no.1自n端起第1-117位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(fr))。所述轻链可变区的氨基酸序列为seq id no.2自n端起第1-107位，或者与seq id no.2自n端起第1-107位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(fr))。
54.所述抗体的重链恒定区为人igg4恒定区，具体氨基酸序列如seq id no.1自n端起第118-444位所示。所述抗体的轻链恒定区为人kappa轻链恒定区，具体氨基酸序列如seq id no.2自n端起第108-214位所示。
55.更进一步地，所述重链的氨基酸序列为seq id no.1，或者与seq id no.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(fr))。所述轻链的氨基酸序列为seq id no.2，或者与seq id no.2具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(fr))。
56.本发明所述抗体可以是任何类别，如igg、igm、ige、iga或igd。优选4-1bb抗体是igg类别，如igg1、igg2、igg3或igg4亚型，更优选igg4亚型。
57.本发明所述抗体的轻链类型可以是κ链，也可以是λ链，优选为kappa链。
58.在本发明的具体实施方式中，所述抗体具体为抗人4-1bb的人源化抗体hanke10f4。所述hanke10f4主要结合人4-1bb胞外区的domain1和domain 2a。
59.本发明所提供的抗体具有如下一或多种性质或特性：
60.1)特异性结合人4-1bb；
61.2)结合人和食蟹猴4-1bb；
62.3)结合人或食蟹猴4-1bb；
63.4)一定程度上，能阻断人4-1bbl(4-1bb配体)与人4-1bb的结合；
64.5)是igg，如igg1、igg2、igg3或igg4；
65.6)是人抗体，或者人源化抗体。
66.本发明所述抗体或其抗原结合片段对人4-1bb具有激动剂活性，能刺激cd4
+
tcd8
+
t细胞增殖，显著增加ifn-γ的表达量，一定程度上说明所述抗体或其抗原结合部分可以通过调节免疫细胞活性进而对免疫系统进行调控，能够运用于免疫增强物抗肿瘤或抗病毒免疫反应的免疫增强物，或t细胞介导的自身免疫疾病的免疫调节物。
67.本发明的抗体可通过本领域已知的方法制备，包括常规的单克隆抗体技术。可通过在转染的细胞诸如永生化的真核细胞诸如骨髓瘤或杂交瘤细胞中表达来制备。抗体可以通过本领域已知的方法从一个类别或亚型转变为另一个类别或亚型。此外，本发明提供的抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体，优选单克隆抗体。
68.本发明所述的抗体可以通过本领域已知的技术产生，包括常规的单克隆抗体技术，例如标准的体细胞杂交技术，b淋巴细胞的病毒或致癌基因转化，或重组抗体技术，如下文详述。
69.杂交瘤产生是常用的方法，为本领域已知。首先，瞬转表达人4-1bb蛋白，免疫balb/c小鼠。人4-1bb抗原氨基酸序列如seq id no.5所示(其中第24-184位为胞外区)，免疫抗原是分离的或者纯化的人4-1bb，可以是人4-1bb片段，如人4-1bb的胞外结构域。动物免疫，可以是本领域已知的任何方法进行，免疫非人动物如小鼠、大鼠、绵羊等。在用人4-1bb抗原免疫动物之后，从分离自免疫的动物的细胞中制备产生抗体的永生化细胞系。在免疫后，处死动物，获得永生化淋巴结和/或脾b细胞，用常规方法进行细胞融合，用elisa法筛选阳性细胞克隆，即产生抗4-1bb抗体的细胞，再反复亚克隆，进一步筛选，选择生长状态良好、抗体产量高、培养上清100％阳性的杂交瘤。杂交瘤可以在同系动物、缺少免疫系统的动物及裸鼠体内扩增或者在体外细胞培养中扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法为本领域技术人员熟知。用双相琼脂扩散实验检测杂交瘤细胞分泌的免疫球蛋白亚型为igg1。本发明抗体也可以用噬菌体展示方法制备。这种用于分离人抗体的噬菌体展示方法是本领域已经建立的。
70.所述抗体生产表达后，包含抗体、二聚体、单个轻、重链，或其他免疫球蛋白形式，可根据本领域标准方法纯化，诸如硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析，凝胶电泳等。
71.其中，所述抗原结合片段可包含如下中的一种或多种：(1)前文所述抗体的轻链；(2)前文所述抗体的重链；(3)前文所述抗体的轻链可变区；(4)前文所述抗体的重链可变区；(5)前文所述抗体的一或多个cdr区。
72.进一步地，所述抗原结合片段可为如下任一：(1)fab片段，其是有vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(2)f(ab’)2片段，其是二价片段，包含铰链区由二硫键链接的两个fab片段；(3)fd片段，由vh和ch1结构域组成；(4)fv片段，由抗体的单臂的vl和vh结构域组成；(5)分离的cdr(如来自轻链的cdr和/或来自重链的cdr)；(6)单链抗体等，其中单链抗体可以为scfv结构，相比于fv片段多了linker结构，单链抗体可以带不同标签，如scfv-his，
scfv-fc等。
73.在本发明的具体实施方式中，本发明提供的抗原结合片段是单链抗体(scfv)。单链抗体(scfv)由包含连接与vh结构域的vl结构域的单个多肽链组成，其中vl结构域和vh结构域被配对以形成单价分子。单链抗体可以根据本领域已知方法制备。
74.其中，所述核酸分子可以是dna或rna，可以包含或不包含内含子序列。优选的，所述核酸分子是cdna分子。
75.进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链可变区中hcdr1、hcdr2和hcdr3的核苷酸序列依次如seq id no.3自5’端起第91-105位、第148-192位、第292-318位所示；编码所述抗体的轻链可变区中lcdr1、lcdr2和lhcdr3的核苷酸序列依次如seq id no.4自5’端起第70-102位、第148-168位、第265-291位所示。
76.更进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的所述重链可变区的核苷酸序列为seq id no.3自5’端起第1-351位或者与seq id no.3自5’端起第1-351位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(fr))。编码所述抗体的所述轻链可变区的核苷酸序列为seq id no.4自5’端起第1-321位或者与seq id no.4自5’端起第1-321位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(fr))。
77.在所述核酸分子中，编码所述抗体的所述重链恒定区变区的核苷酸序列为seq id no.3自5’端起第352-1332位。编码所述抗体的所述轻链恒变区的核苷酸序列为seq id no.4自5’端起第322-642位。
78.更加具体地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链的核苷酸序列为seq id no.3或者与seq id no.3具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(fr))。编码所述抗体的轻链的核苷酸序列为seq id no.4或者与seq id no.4具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(fr))。
79.本发明的核酸分子可以用合适的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤表达的抗体，可以通过pcr扩增或者cdna克隆技术获得编码由所述杂交瘤制备的抗体轻链和重链的cdna。
80.本发明的核酸分子可以编码轻链或重链的一部分、全长轻链或重链，或抗体衍生物或其抗原结合片段的氨基酸序列。
81.编码vh的分离的dna可以通过将编码vh的dna连接于编码重链恒定区(ch1、ch2和ch3)的另一个dna分子而转化为全长重链基因。人类重链恒定区基因序列是本领域已知的，包含这些区域的dna片段可以通过标准pcr扩增获得。重链恒定区可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区。优选的是igg4恒定区。
82.编码vl区的分离的dna可以通过将编码的vl的dna连接于编码轻链恒定区cl的另一个dna分子而转化为全长轻链基因。人类轻链恒定区基因序列是本领域已知的，包含这些区域的dna片段可以通过标准的pcr扩增获得。轻链恒定区可以是kappa或lambda恒定区。
83.其中，所述载体是可用于结合分子如抗体或其抗原结合片段表达的表达载体。
84.为表达本发明的抗体，编码部分或全长轻链和重链的dna被插入表达载体，开始该dna分子的转录和翻译。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入单独载体中，或者插入相同
表达载体中。插入方法可以是已知的任何合适的方法，如抗体基因片段上的互补限制位点与载体的链接。本发明描述的抗体的轻链和重链可变区可用于产生任何抗体种型和亚型的全长抗体基因。
85.本发明进一步提供含本发明提供核酸分子的宿主细胞(即所述重组细胞)。所述宿主细胞可以是表达载体可利用的任何细胞。例如高等真核宿主细胞，如哺乳动物细胞包含例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞，低等真核宿主细胞，如酵母细胞，及可以是原核细胞，如细菌细胞、大肠杆菌等。重组核酸构建体导入宿主细胞中的转染方法如电穿孔、磷酸钙转染、deae-葡聚糖、脂质转染、噬菌体感染等。可通过已知方法将当编码抗体基因的表达载体导入宿主细胞中，通过将该宿主细胞培养足以使得结合分子在宿主细胞中表达，由此产生抗体。
86.所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒可为pcdna3.4和pcdna3.4-l或其他。
87.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明所述抗4-1bb抗体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明所述抗4-1bb抗体的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或75％以上的同一性的核苷酸，只要编码所述抗4-1bb抗体且具有所述抗4-1bb抗体活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
88.在本发明的具体实施方式中，将seq id no.3所示dna片段(抗体重链的编码基因)克隆到pcdna3.4载体的酶切位点xba i和hand iii之间后得到表达所述抗体的重链的重组表达载体(命名为pcdna3.4-h)；将seq id no.4所示dna片段(抗体轻链的编码基因)克隆到pcdna3.4载体的酶切位点xba i和hand iii之间后得到表达所述抗体的轻链的重组表达载体(命名为pcdna3.4-l)。为了更加有利于蛋白表达，构建所述重组表达载体时，在seq id no.3和seq id no.4所示dna片段(抗体重链和轻链的编码基因)的上游还引入了kozak共识别序列(5
’-
gccacc-3’)和信号肽的编码序列(5
’-
atggagtttgggctgagttgggtctttctggtcgcaattctgctgaagggagtgcagtgc-3’)，信号肽的编码序列与seq id no.3和seq id no.4的5’端相连。所述重组细胞为将上述分别表达所述抗体重链和轻链的两个重组表达载体(pcdna3.4-h和pcdna3.4-l)共转染hek293细胞后得到的重组细胞。所述重组细胞即可表达前文所述抗体hanke10f4。
89.实验证明，本发明所提供的抗体能结合人4-1bb，并对人4-1bb表现高亲和力以及有效增强t细胞反应。一方面所述抗体在一定程度上与人4-1bbl竞争性结合人4-1bb，另一方面，所述抗体诱导共刺激测定法中inf-γ的生成。本发明所述抗体，可用于调节t细胞和抗体介导的免疫反应。
90.本发明抗体与人4-1bb的结合导致免疫反应增强。本发明提供的抗体及其抗原结合片段可用作免疫增强物，或t细胞介导的自身免疫疾病的免疫调节物。所述抗体及其抗原结合片段也可用作诊断工具检测癌症、自身免疫或其他疾病的患者的血液或组织中的4-1bb。
91.本发明提供的抗体及其抗原结合片段作为免疫调节物具有广泛的治疗用途，所述疾病诸如癌症、自身免疫疾病、炎症疾病、和感染疾病等。
附图说明
92.图1为杂交瘤抗体sds-page。
93.图2为抗体结构图。
94.图3为杂交瘤分泌抗体识别人4-1bb。
95.图4为杂交瘤分泌抗体识别猴4-1bb。
96.图5为抗原结合片段识别人4-1bb。
97.图6为抗原结合片段识别猴4-1bb。
98.图7为hankering10f4和hkb6亲和力比较。
99.图8为抗体hanke10f4阻断4-1bbl与4-1bb结合。
100.图9为抗体hanke10f4与对照抗体表位竞争。
101.图10为hanke10f4和hkb6表位竞争。
102.图11为萤光素酶活性测定。
103.图12为抗体hanke10f4激活cd4
+
t细胞效应检测。图中每组三个柱形图由左到右依次分别为抗体高、中、低(2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml)浓度条件下cd4
+
t细胞的激活效应。
104.图13为抗体hanke10f4激活cd8
+
t细胞效应检测。图中每组三个柱形图由左到右依次分别为抗体高、中、低(3μg/ml、0.5μg/ml、0.08μg/ml)浓度条件下t细胞的激活效应。
105.图14为抗体hanke10f4抑制肿瘤生长。
106.图15为抗体hanke10f4毒理检测。
具体实施方式
107.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
108.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
109.下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
110.下述实施例中，阳性对照抗体为pfizer公司的utomilumab(pf-05082566，专利号：us8337850 b2)和bristol myers squibb公司的urelumab(bms-663513，专利号：us7288638 b2)，这两种抗体均为抗人4-1bb抗体。阴性对照抗体为人igg(南京金斯瑞产品)。
111.下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna的3
′
末端核苷酸。
112.下述实施例中的pcdna3.4载体(invitrogen，cat:a14697)。
113.常规器材和试剂如下：
114.1、96孔酶标板(nunc公司)；
115.2、铺板缓冲液：ph为7.0的磷酸盐缓冲液；
116.3、洗涤液：仅含0.05％体积百分含量tween 20的ph为7.0的磷酸盐缓冲液；
117.4、封闭液：仅含10g/l bsa的洗涤液。
118.5、辣根过氧化物酶标记亲和素；
119.6、显色底物：四甲基联苯胺；
120.7、终止液：1m硫酸。
121.其中，所述ph为7.0的磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠；所述氯化钠在所述ph为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为135mm，所述氯化钾
在所述ph为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为2.7mm，所述磷酸二氢钾在所述ph为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度1.5mm，所述磷酸氢二钠在所述ph为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为8mm。
122.实施例1、杂交瘤抗体的制备
123.1.1小鼠免疫
124.选用4～6周龄的balb/c小鼠3只和c57b1/6小鼠3只，以人4-1bb胞外段(seq id no.5的第24-186位)为抗原免疫小鼠，每2周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后尾静脉采血，用间接elisa检测抗体产生情况，选择合适的免疫的小鼠，摘眼球后脱颈处死，无菌摘取小鼠脾细胞，，按常规方法进行细胞融合制备抗人4-1bb单克隆抗体杂交瘤细胞株。
125.1.2杂交瘤筛选
126.用elisa筛选抗人4-1bb单克隆抗体杂交瘤细胞。用10μg/ml人4-1bb(seq id no.5)包被elisa板，于4℃过夜并封闭。依次加入待测细胞培养上清液，于37℃孵育1小时，再用pbst洗板3次，加入4000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(thermofisher公司)于37℃孵育45min，pbst洗板3次后，用四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，tmb)(thermofisher公司)底物显色后，于450nm波长测定od值。
127.用elisa法筛选阳性的细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。杂交瘤细胞的克隆化用有限稀释法。将培养板置于37℃、5％的co2孵箱中培养，约5天后在显微镜下可观察到细胞克隆。适时换液，检测，取阳性并且长势好的单克隆细胞株进行扩大培养，即得到抗人4-1bb单克隆抗体杂交瘤细胞株，及时冻存细胞株。
128.1.3杂交瘤抗体鉴定
129.将筛选所得阳性并且长势好的抗人4-1bb抗体杂交瘤细胞株逐级扩大培养，离心(10000rpm离心10分钟)，取上清，将所得上清用protein g亲和层析柱纯化。具体操作是：先用pbs平衡protein g柱(ge公司)，然后培养上清过柱，先采用a液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mm磷酸钠、500mm nacl，ph5.0)预洗脱5个柱体积，再采用b液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mm醋酸钠、150mm nacl，ph3.5)洗脱5个柱体积，收集洗脱峰，然后30kda浓缩离心管浓缩获得抗体。
130.免疫得到15个杂交瘤抗体细胞株，通过筛选，最终得到6个候选杂交瘤母细胞株，通过亚型鉴定及初步筛选后，细胞株详情及分别对应抗体如表1所示。
131.表1抗人4-1bb杂交瘤细胞株
132.序号编号抗体亚型融合细胞137g10f4igg1,κsp2/0223c2e9igg1,κsp2/032c2f2igg1,κsp2/0432c2g6igg2b,κsp2/0513f8h8igm,κsp2/0637g11e2b3igm,κsp2/0
133.淘汰13f8h8和37g11e2b3两个候选，收集细胞上清，分别纯化、浓缩，对样品进行sds-page电泳，电泳检测结果如图1所示。
134.对得到的抗人4-1bb抗体进行测序，结果显示，所得抗人4-1bb抗体为分子量大小为150kb，包含重链和轻链，为典型的完整抗体。抗体结构如图2所示。
135.1.4杂交瘤分泌抗体识别人4-1bb
136.通过elisa评估4种杂交瘤分泌抗体识别人4-1bb的亲和力。96孔板(96孔酶标板，nunc公司)用人4-1bb(seq id no.5)包被，浓度为1μg/ml，100μl/孔，4℃过夜。洗板三次，每孔加300μl封闭液(配方见上文)，37℃封闭1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，将抗体用样品稀释液(pbs-t加入1％牛血清白蛋白)稀释到4000ng/ml，再用7个ep管4倍稀释成梯度溶液，每个浓度设置两个复孔，100μl/孔，孵育1小时。用洗涤液洗板三次，每孔加稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠(thermofisher公司)100μl，振荡0.5小时。洗板三次，每孔加四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，tmb)(thermofisher公司)100μl。避光显色，加1m的硫酸终止反应。用bio-tek elx-800酶标仪在450nm下测od值。
137.通过上述步骤，杂交瘤分泌抗体均能识别并结合人4-1bb，elisa结果od450值如表2所示，分析图如图3所示。
138.表2杂交瘤分泌抗体识别人4-1bb
[0139][0140]
1.5杂交瘤分泌抗体识别猴4-1bb
[0141]
采用elisa方法评估杂交瘤分泌抗体识别猴4-1bb的亲和力。具体将猴4-1bb(cy4-1bb)(seq id no.6)抗原用铺板缓冲液(配方见上文)稀释到1μg/ml，每孔加100μl铺板，4℃过夜。将杂交瘤分泌抗体与阳性对照抗体utomilumab用样品稀释液稀释到1000ng/ml，再用7个ep管10倍稀释成梯度溶液，每个浓度设置两个复孔，每孔100μl加入板内，振荡1小时。再次洗板后，每孔加稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠(thermofisher公司)100μl，振荡0.5小时。清洗之后，加四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，tmb)(thermofisher公司)100μl显色。
[0142]
通过上述步骤，实验证明杂交瘤分泌抗体均能识别cy4-1bb分子，elisa结果od450值如表3所示，分析图如图4所示。
[0143]
表3杂交瘤分泌抗体识别猴4-1bb
[0144]
[0145][0146]
实施例2、抗体人源化及scfv-fc抗原结合片段性质鉴定
[0147]
选择得自如本发明所述淘选的分泌型抗体37g10f4。分析抗体基因序列，然后通过抗体fab的同源建模与优化，表面扫描确定人源化突变位点，虚拟突变与分子动力学模拟，确定关键氨基酸等一系列分析设计合理的人源化抗体。通过人源化改造，得到12个候选scfv-fc(人igg4)形式的抗原结合片段，用于如本实施例所述进一步鉴定。表达和纯化候选scfv-fc分子，然后在elisa中鉴定(包括鉴定其对人和猴4-1bb识别能力，具体方法参见实施例1相关步骤)，具体如表4所示，elisa结果如图5和图6所示。
[0148]
表4 scfv-fc分子识别人4-1bb
[0149][0150][0151]
注：表中12个候选scfv-fc的重链和轻链的cdr区是相同的，框架区(fr)存在氨基
酸突变。
[0152]
实施例3、igg人源化抗体
[0153]
本实施例鉴别的实施例性抗体hanke10f4，为从杂交瘤分泌型抗体37g10f4人源化改造得到，即从表4中的scfvb60103转变而来。本实施例将详述表达和纯化hanke10f4，然后在elisa、facs、荧光素酶报告基因测定、t细胞激活体系中鉴定。
[0154]
3.1抗体表达与纯化
[0155]
根据测序得到的基因序列，合成全长基因序列，hanke10f4抗体的重链编码基因如seq id no.3所示，hanke10f4抗体的轻链编码基因如seq id no.4所示。
[0156]
seq id no.3的第1-351位为重链可变区vh的编码基因，其中cdr1、cdr2和cdr3的编码序列分别如seq id no.3的第91-105位、第148-192位、第292-318位所示。
[0157]
seq id no.4的第1-321位为轻链可变区vl的编码基因，其中cdr1、cdr2和cdr3的编码序列分别如seq id no.4的第70-102位、第148-168位、第265-291位所示。
[0158]
分别在seq id no.3和seq id no.4的5’端依次加上xbai的识别序列(5
’-
tctaga-3’)、kozak共识别序列(5
’-
gccacc-3’)和信号肽的编码序列(5
’-
atggagtttgggctgagttgggtctttctggtcgcaattctgctgaagggagtgcagtgc-3’)，信号肽的编码序列与seq id no.3和seq id no.4的5’端相连，然后分别在seq id no.3和seq id no.4的3’末端依次加上终止子(tga)和hindiii的识别序列(5
’-
aagctt-3’)，tga与seq id no.3和seq id no.4的3’端相连，将得到的新的dna序列分别记为重链基因甲和轻链基因甲。人工合成重链基因甲，将重链基因甲用xbai和hindiii酶切后与经xbai和hindiii酶切pcdna3.4载体得到的载体骨架连接，得到重组载体，将经测序验证正确的重组载体命名为pcdna3.4-h；将轻链基因甲用xbai和hindiii酶切后与经xbai和hindiii酶切pcdna3.4载体得到的载体骨架连接，得到重组载体，将经测序验证正确的重组载体命名为pcdna3.4-l。
[0159]
将pcdna3.4-h和pcdna3.4-l导入到人胚胎肾细胞系hek293f(atcc美国细胞库)，得到重组细胞，然后将重组细胞放入37℃、5％co2振荡培养箱中培养，转速120rpm。
[0160]
利用protein a亲和层析柱从培养上清中纯化抗体蛋白。具体操作是：先用pbs平衡protein a柱(ge公司)，然后培养上清过柱，先采用a液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mm磷酸钠、500mm nacl，ph5.0)预洗脱5个柱体积，再采用b液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mm醋酸钠、150mm nacl，ph3.5)洗脱5个柱体积，收集洗脱峰，然后30kda浓缩离心管浓缩获得所述抗体即获得抗人4-1bb抗体。
[0161]
对抗人4-1bb抗体进行测序，结果显示，所得抗人4-1bb抗体为完整抗体，即该抗体为hanke10f4。该抗体由重链和轻链组成，重链的氨基酸序列为序列如seq id no.1所示，轻链的氨基酸序列如seq id no.2所示。hanke10f4抗体的重链类型为igg4，轻链类型为κ链。
[0162]
seq id no.1的第1-117位为重链可变区vh，其中cdr1、cdr2和cdr3的序列分别如seq id no.1的第31-35位、第50-64位、第98-106位所示。
[0163]
seq id no.2的第1-107位轻链可变区vl中cdr1、cdr2和cdr3的序列分别如seq id no.2的第24-34位、第50-56位、第89-97位所示。
[0164]
3.2对人或猴4-1bb亲和力鉴定
[0165]
(1)elisa检测
[0166]
方法参见实施例1中步骤1.4，分别以人4-1bb或猴4-1bb直接包被96孔板，抗体样
品(hanke10f4和utomilumab)为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗鼠为二抗。四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，tmb)为显色试剂，硫酸终止显色。用bio-tekelx-800酶标仪在450nm下测od值。
[0167]
表5显示igg4形式的抗体hanke10f4的elisa结果，与人4-1bb和猴4-1bb均能识别。
[0168]
表5 elisa测定中hanke10f4的结合
[0169][0170][0171]
(2)facs检测
[0172]
所用试剂包括：
[0173]
facs缓冲液，该缓冲液为向pbs中添加bsa和叠氮化钠得到的溶液，该缓冲液中bsa的质量百分比浓度为2％，叠氮化钠的质量百分比浓度为0.02％；羊抗人fitc二抗(sigma公司，避光保存)。
[0174]
实验所用细胞为合肥瀚科迈博公司构建的细胞膜表面高表达人4-1bb的cho-k1细胞(cho-k1-hu4-1bb)和细胞膜表面高表达猴4-1bb的cho-k1细胞(cho-k1-cy4-1bb)以及无4-1bb表达的野生型cho-k1(来自于中科院上海细胞库)。
[0175]
人工合成人4-1bb基因序列(seq id no.7)和猴4-1bb基因序列(seq id no.8)，然后按照本领域通用方法分别插入pcdna3.4载体，然后分别用lipofectamine 3000转染试剂(invitrogen公司)导入到野生型cho-k1细胞。再加入g418(购于生工生物工程(上海)股份有限公司)加压筛选，最终得到细胞膜高表达人4-1bb的cho-k1细胞(cho-k1-hu4-1bb)和细胞膜表面高表达猴4-1bb的cho-k1细胞(cho-k1-cy4-1bb)。
[0176]
使用cho-k1-hu4-1bb检测hanke10f4单克隆抗体与人4-1bb结合活性。使用t75瓶培养待测细胞至80％满度，胰酶消化，1000rpm离心5min，收集细胞(每瓶细胞数在106个左右)，用约1ml缓冲液重悬清洗、离心并重悬细胞，得到细胞悬液，细胞浓度为1
×
107个细胞/ml。准备各个稀释梯度的hanke10f4抗体稀释液25μl，向加有不同浓度抗体的各离心管中加入25μl的细胞悬液混匀，最终抗体浓度如表6中所示，将加入抗体浓度为0μg/ml的抗体稀释
液的离心管作为空白对照。孵育30min后，用1ml facs缓冲液清洗两次后，加入羊抗人fitc二抗，吹打重悬，避光孵育30min。再次用1ml facs缓冲液清洗两次，然后每管加入500μl facs缓冲液重悬，置于冰上避光，上机检测。将抗体utomilumab(辉瑞制药有限公司)作为阳性对照。
[0177]
按照上述步骤，使用cho-k1-cy4-1bb检测hanke10f4单克隆抗体与猴4-1bb结合活性。
[0178]
通过上述步骤，实验证明hanke10f4单克隆抗体与人4-1bb和猴4-1bb分子均具有很高的结合活性，如表6所示。
[0179]
表6 facs检测4-1bb抗体亲和力检测结果
[0180][0181][0182]
(3)facs比较抗体亲和力
[0183]
使用cho-k1-hu4-1bb检测比较hanke10f4、hkb6单克隆抗体与人4-1bb结合活性。使用t75瓶培养待测细胞至80％满度，胰酶消化，1000rpm离心5min，收集细胞(每瓶细胞数在106个左右)，用约1ml缓冲液重悬清洗、离心并重悬细胞，得到细胞悬液，细胞浓度为1
×
107个细胞/ml。准备各个稀释梯度的hanke10f4抗体稀释液25μl或者hkb6抗体稀释液25μl，向加有不同浓度抗体的各离心管中加入25μl的细胞悬液混匀，最终抗体浓度如表7中所示，将加入抗体浓度为0μg/ml的抗体稀释液的离心管作为空白对照。孵育30min后，用1ml facs缓冲液清洗两次后，加入羊抗人fitc二抗，吹打重悬，避光孵育30min。再次用1ml facs缓冲液清洗两次，然后每管加入500μl facs缓冲液重悬，置于冰上避光，上机检测。
[0184]
其中hkb6为专利申请号为201811541545.8中所述hkb6抗体。
[0185]
通过上述步骤，如表7和图7所示，hanke10f4结合人4-1bb的亲和力明显高于hkb6。
[0186]
表7 hankering10f4和hkb6亲和力比较
[0187][0188][0189]
3.3配体竞争
[0190]
使用cho-k1-hu4-1bb比较hanke10f4抗体与人4-1bbl之间竞争结合活性。二抗为sa-fitc(biolegend公司)，其他操作(除下述外)、稀释液同步骤3.2中facs检测。人4-1bbl氨基酸序列如seq id no.9所示。
[0191]
将hanke10f4用生物素标记为bio-hanke10f4，标记方法同本领域常规标记蛋白方法一致。用样品稀释液将bio-hanke10f4稀释浓度为1.5μg/ml的溶液a。同时配制人4-1bbl-higg(或hanke10f4)稀释液b，固定溶液a浓度不变，溶液b浓度为a的一定倍数(具体倍数见表8)。将溶液a和溶液b等比例混匀，与cho-k1-hu4-1bb孵育。
[0192]
同样操作检测反向竞争，将人4-1bbl用生物素标记为bio-4-1bbl，并用样品稀释液稀释浓度为2μg/ml的溶液a。同时配制hanke10f4(或人4-1bbl-higg)稀释液b，固定溶液a浓度不变，溶液b浓度为a的一定倍数(具体倍数见表8)。将溶液a和b等比例混匀，与cho-k1-hu4-1bb孵育。
[0193]
通过上述步骤，实验证明hanke10f4单克隆抗体与人4-1bbl的结合位点有竞争关系，具体结果见表8和图8所示，即该单克隆抗体在一定程度上随着药物剂量会阻断人4-1bb/4-1bbl信号通路。
[0194]
表8 facs检测配体阻断
[0195][0196]
3.4表位竞争
[0197]
3.4.1 hanke10f4与阳性对照抗体抗原结合表位竞争
[0198]
使用cho-k1-hu4-1bb比较hanke10f4抗体与对照抗体utomilumab、urelumab之间表位竞争关系。二抗为sa-fitc(biolegend公司)，其他操作(除下述外)、稀释液同步骤3.2中facs检测。
[0199]
将hanke10f4用生物素标记为bio-hanke10f4，并用样品稀释液稀释浓度为1.5μg/ml的溶液a。同时配制utomilumab、urelumab、hanke10f4抗体稀释液b，固定溶液a浓度不变，溶液b浓度为a的一定倍数(具体倍数见表9)。将溶液a和b等比例混匀，与cho-k1-hu4-1bb孵育。
[0200]
通过上述步骤，重复实验证明hanke10f4单克隆抗体与utomilumab和urelumab的抗原结合位点有一定程度竞争关系，与utomilumab的竞争强于与urelumab的竞争。具体结果见表9和图9所示。
[0201]
表9 facs检测表位竞争
[0202][0203]
3.4.2 hanke10f4与阳性对照抗体抗原结合表位分析
[0204]
将人4-1bb抗原胞外区分段用鼠4-1bb相应胞外区替代，合成不同的目的基因，分
别插入pcdna3.4载体，得到不同4-1bb抗原的dna质粒，通过瞬转得到表达细胞表面不同4-1bb抗原的细胞株，具体见表10。用于facs分析抗体与不同4-1bb抗原的结合活性，进而分析抗体结合人4-1bb胞外区的具体表位。
[0205]
瞬转操作具体使用expi293表达系统(thermo fisher)产品，根据产品说明书操作流程。在optimem中分别加入expi fectamine转染试剂、dna质粒得到溶液a和b，然后将溶液a和溶液b混匀得到溶液c。将溶液c加入expi293细胞(thermo fisher)中，过夜孵育得到细胞表面高表达4-1bb抗原的细胞株。
[0206]
其中，人4-1bb抗原全长氨基酸序列如seq id no.5所示(对应编码基因如seq id no.7所示)，胞外区为第24-186位(对应编码基因如seq id no.7的第70-558位所示)。鼠4-1bb抗原全长氨基酸序列如seq id no.10所示(对应编码基因如seq id no.11所示)，胞外区为第24-187位(对应编码基因如seq id no.11的第70-561位所示)。
[0207]
利用瞬转得到的细胞株，按照步骤3.2中facs检测步骤，依次加入抗体样品(utomilumab、hanke10f4或urelumab)作为一抗与细胞孵育，然后加入羊抗人fitc作为二抗孵育，再次用facs缓冲液清洗两次，然后每管加入500μl facs缓冲液重悬，避光，上机检测。
[0208]
根据专利及文献报道分析，utomilumab主要结合人4-1bb胞外区的domain 3和domain 4，urelumab主要结合人4-1bb胞外区的domain1。通过上述操作，可以得知urelumab的荧光强度趋势在细胞a和f两组降低，utomilumab在细胞b、c和d三组降低，符合研究报道。而hanke10f4荧光强度趋势在细胞a和f两组降低，且在细胞a组大幅度降低，降低程度远远低于urelumab的降低程度，又因为hanke10f4的荧光强度在细胞b组不降反增，因此说明domain1和2a对于hanke10f4与人4-1bb的亲和很关键，而domain2b、3a、3b影响不大，hanke10f4主要结合人4-1bb胞外区的domain1和domain 2a区域，与对照抗体utomilumab和urelumab的抗原结合表位均不相同(表10)。hanke10f4与阳性对照抗体又具有一定程度的竞争关系，这种竞争关系可能由于抗原抗体的空间表位导致。
[0209]
表10抗体结合人4-1bb表位平均荧光强度分析
[0210][0211]
注：细胞a中抗原的具体结构“人4-1bb+鼠4-1bb domain1,2a,2b(aa24-86)”指的是将seq id no.5所示的人4-1bb抗原全长中的第24-86位的氨基酸替换为seq id no.10所示的鼠4-1bb抗原全长中第24-86位的氨基酸。细胞b中抗原的具体结构“人4-1bb+鼠4-1bb domain2b,3a,3b(aa64-118)”指的是将seq id no.5所示的人4-1bb抗原全长中的第64-118位的氨基酸替换为seq id no.10的第64-118位氨基酸。细胞c中抗原的具体结构“人4-1bb+鼠4-1bb domain3a,3b,4a(aa87-133)”指的是将seq id no.5所示的人4-1bb抗原全长中的第87-133位的氨基酸替换为seq id no.10的第87-133位氨基酸。细胞d中抗原的具体结构“人4-1bb+鼠4-1bb domain3b,4a,4b(aa97-159)”指的是将seq id no.5所示的人4-1bb抗原全长中的第97-159位的氨基酸替换为seq id no.10的第97-159位氨基酸。细胞e中抗原的具体结构“人4-1bb+鼠4-1bb domain4a,4b,nf(aa119-186)”指的是将seq id no.5所示的人4-1bb抗原全长中的第119-186位的氨基酸替换为seq id no.10的第119-186位氨基酸。细胞f中抗原的具体结构“人4-1bb+鼠4-1bb domain1,4b,nf(aa24-46,aa139-186)”指的是将seq id no.5所示的人4-1bb抗原全长中的第24-46以及139-186位的氨基酸替换为seq id no.10的第24-46以及139-186位氨基酸。
[0212]
3.4.3 hanke10f4与hkb6抗原结合表位竞争
[0213]
使用cho-k1-hu4-1bb比较hanke10f4抗体与hkb6之间抗原结合表位竞争关系。二抗为sa-fitc(biolegend公司)，其他操作(除下述外)、稀释液同步骤3.2中facs检测。
[0214]
将hanke10f4用生物素标记为bio-hanke10f4，并用样品稀释液稀释浓度为1.5μg/ml的溶液a。同时配制hkb6、hanke10f4抗体稀释液b，固定溶液a浓度不变，溶液b浓度为a的一定倍数(具体倍数见表11)。将溶液a和b等比例混匀，与cho-k1-hu4-1bb孵育。
[0215]
通过上述步骤，实验证明hanke10f4单克隆抗体与hkb6没有竞争关系，即两个抗体的抗原结合表位不同，具体结果见表11和图10所示。
[0216]
表11 hanke10f4和hkb6表位竞争
[0217][0218]
3.5荧光素酶报告基因
[0219]
制备表达人4-1bb以及稳定整合的nfκb萤光素酶报告基因的hek293细胞。将人4-1bb序列(seq id no.7)作为目的基因插入pcdna3.4载体中，得到质粒a，同时将nfκb元件序列(seq id no.12)以及荧光素酶基因(seq id no.13)作为目的基因，按照本领域通用方法分别插入pgl4.10载体(优宝生物)中不同位点，得到质粒b。，然后用lipofectamine 3000转染试剂(invitrogen公司)将a、b两种质粒一起导入到hek293细胞(中科院上海细胞库)。再加入g418(购于生工生物工程(上海)股份有限公司)加压筛选，最终得到表达人4-1bb以及稳定整合的nfκb萤光素酶报告基因的hek293细胞。培养并收获细胞，洗涤及重悬于无酚红完全培养基(dmem，含有10％胎牛血清)，将40μl细胞铺板于黑色96孔平板(corning，3603)中，为5
×
104个/孔。在存在2:1比例交联抗体fab’羊抗人igg fc(jackson，109-006-008)的条件下，每孔加入检测抗体。将平板在细胞培养箱孵育6小时，加入40μl的one-glo luciferase assay sysytem试剂(promega)孵育10min，检测化学发光值。
[0220]
通过上述步骤，实验证明hanke10f4单克隆抗体与utomilumab均能激活报告基因表达信号，具体结果见图11所示。这说明hanke10f4与utomilumab具有类似功能，均能激活t细胞活化信号通路，进而促进t细胞分泌细胞因子，启动t细胞免疫功能。
[0221]
3.6体外药效
[0222]
3.6.1 cd4
+
t细胞激活效应检测
[0223]
将anti-cd3抗体(biolegend,货号317325)利用pbs稀释到1μg/ml，得到anti-cd3抗体溶液；将hanke10f4抗体取高、中、低三个浓度，利用pbs进行稀释，分别得到hanke10f4抗体浓度为4μg/ml、0.4μg/ml、0.04μg/ml的溶液。将anti-cd3抗体溶液分别与三种浓度的hanke10f4抗体溶液按照1:1的体积比混合均匀后，加入96孔板包板，50μl/孔，设3个复孔，将96孔板静置于37℃孵育1小时。第二天使用前，用pbs清洗三次。设置阳性对照抗体为utomilumab，阴性对照抗体为igg(biolegend,货号403601)。
[0224]
人cd4
+
t细胞分离：从健康人中抽取全血，使用淋巴细胞分离液(sigma公司)，按照其说明书操作分离pbmc细胞，并使用人cd4
+
t细胞磁珠(bd公司，货号557767)，根据说明书分离纯化得到人cd4
+
t细胞，备用。
[0225]
将cd4
+
t细胞加入37℃孵育好包板后的96细胞培养板中，密度为1
×
105个/孔，再将96孔板放于37℃，5％co2培养箱中培养3天，收集细胞上清，elisa检测细胞因子inf-γ的分泌量。
[0226]
通过上述步骤，实验证明hanke10f4抗体与utomilumab类似，均能刺激cd4+t细胞活化并分泌细胞因子inf-γ。具体结果见图12所示。
[0227]
3.6.2 cd8
+
t细胞激活效应检测
[0228]
将anti-cd3抗体利用pbs稀释到0.5μg/ml，加入96孔板(corning)，60μl/孔，将96孔板静置于37℃孵育1小时。用pbs清洗，然后将cho-k1稳转细胞株(cho-k1-cd32a或cho-k1-cd32b或cho-k1)加入96孔板，100μl/孔，1
×
104个/孔。再将96孔板置于细胞培养箱过夜。
[0229]
实验所用细胞为合肥瀚科迈博公司构建的细胞膜表面高表达人fcγr||a(cd32a)的cho-k1细胞(cho-k1-cd32a)和细胞膜表面高表达人fcγr||b(cd32b)的cho-k1细胞(cho-k1-cd32b)和cho-k1细胞。
[0230]
人工合成人fcγr||a的编码基因序列(seq id no.14)以及人fcγr||b的编码基因序列(seq id no.15)，然后分别按照本领域通用方法插入pcdna3.4载体，然后分别用lipofectamine 3000转染试剂(invitrogen公司)导入到野生型cho-k1细胞。再加入g418(购于生工生物工程(上海)股份有限公司)加压筛选，最终得到细胞膜高表达人fcγr||a的cho-k1细胞(cho-k1-cd32a)和细胞膜表面高表达人fcγr||b的cho-k1细胞(cho-k1-cd32b)。
[0231]
人cd8
+
t细胞分离：从健康人中抽取全血，使用淋巴细胞分离液(sigma公司)，按照其说明书操作分离pbmc细胞，并使用人cd8
+
t细胞磁珠(bd公司，货号557766)，根据说明书分离纯化得到人cd8
+
t细胞，备用。
[0232]
96孔板过夜孵育后，将细胞上清吸除，再每孔加入100μl人cd8
+
t细胞，1
×
105个/孔。再将抗体用培养基稀释到目标浓度加入96孔板，100μl/孔，最终浓度分别为：3μg/ml、0.5μg/ml、0.08μg/ml，每个浓度设置3个复孔。将96孔板放入细胞培养箱孵育3天，用elisa法检测细胞培养上清中细胞因子inf-γ的分泌量。
[0233]
通过上述步骤，实验证明hanke10f4抗体与utomilumab、urelumab类似，均能刺激t细胞活化，并且对于t细胞的活化依赖于fcγr||a、fcγr||b。具体结果见图13所示。
[0234]
3.7体内药效
[0235]
实验选择b-hcd137(4-1bb)小鼠检测hanke10f4体内抗肿瘤药效。b-hcd137(4-1bb)小鼠模型是基因工程鼠，是在遗传背景c57bl/6小鼠的基因组嵌合有人源的h4-1bb基因，来自百奥赛图。
[0236]
将mc38细胞(小鼠结肠癌细胞)(atcc)培养至80％满度，胰酶消化，1000rpm离心5min，收集细胞，清洗、离心并重悬细胞，得到细胞悬液，保证细胞活率>95％，备用。
[0237]
在受试小鼠后背(剃毛)一侧皮下接种mc38细胞系(每只小鼠接种2
×
106细胞，100μl)。当荷瘤鼠平均瘤体积达到100-150mm3时，将小鼠按实验设计随机分入4组，每组6只。设置hanke10f4和utomilumab每次给药浓度为1mg/kg，urelumab每次给药浓度为0.3mg/kg，每周给药2次，给药3周。将抗体根据浓度需要用生理盐水稀释，保存在4℃冰箱，皮下注射给药，每周2次。在肿瘤接种后，每周两次检查动物生存和活动情况。包括：肿瘤生长情况，活动
能力，饮食，体重和其他异常行为。
[0238]
通过上述步骤，实验证明hanke10f4抗体与utomilumab、urelumab类似，均能抑制mc38肿瘤生长，并且不影响小鼠活动能力及体重，hanke10f4与utomilumab抗体的抗肿瘤药效几乎一致。具体结果见图14所示。
[0239]
3.8体内毒理
[0240]
实验选择b-hcd137(4-1bb)小鼠检测hanke10f4体内抗肿瘤药效。b-hcd137(4-1bb)小鼠模型是基因工程鼠，是在遗传背景c57bl/6小鼠的基因组嵌合有人源的h4-1bb基因，来自百奥赛图。
[0241]
将受试小鼠随机分为4组，分别给生理盐水、hanke10f4、utomilumab及urelumab，每周给药2次，给药3周，每次给药浓度为30mg/kg。给药结束后，断尾取血，检测小鼠外周血中ast(谷草转氨酶)与alt(谷丙转氨酶)的含量。如图15，urelumab相比于生理盐水组，ast含量显著升高，表示该抗体具有肝毒性风险，而hanke10f4与utomilumab的ast和alt含量均与生理盐水组无明显区别，表明hanke10f4与utomilumab同样具有低毒性。