一种絮缘蘑菇菌株及其栽培方法与应用与流程

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种具有食用价值的蘑菇属真菌及其应用。

背景技术：

絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus）在分类学上隶属于真菌界（fungi）、担子菌门（basidiomycota）、伞菌纲（agaricomycetes）、蘑菇目（agaricales）、伞菌科（agaricaceae）、伞菌属（agaricus）。伞菌属（agaricus），是蘑菇科（agaricaceae）的模式属，主要特征为：菌盖多具鳞片；菌柄中生，具菌环；菌褶离生，初期为白色，后期变为粉红色、浅棕色、红棕色至深棕色；菌肉大多由非淀粉反应的菌丝构成；孢子浅棕色至深棕色。蘑菇属在全世界分布较广，有400多种。我国蘑菇属从辽宁、内蒙古、吉林、黑龙江到云南、四川、甘肃、西藏、新疆都有分布，但在中国仅约50多种被报道。

甘肃祁连山国家级自然保护区位于甘肃省境内祁连山北坡中、东段，地跨武威、金昌、张掖3市的凉州、天祝藏族自治县、古浪、永昌、甘州、山丹、民乐、肃南裕固族自治县8县（区），地理位置位于东经97°23′34′′－103°45′49′′，北纬36°29′57′′－39°43′39′′之间，总面积198.72万公顷，功能区划分为核心区50.41万公顷，缓冲区38.74万公顷，实验区109.57万公顷，甘肃祁连山国家级自然保护区地处甘肃省境内祁连山东段。地理位置e97°25′～103°38′、n36°45′～39°40′，属温带高寒半干旱山地森林草原气候，年均气温0.7℃，年降水量433.6mm，年均相对湿度60%。作者在对甘肃祁连山自然保护区进行大型真菌调查期间，在保护区内采集到絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus），絮缘蘑菇广泛分布在北半球，可食用，味道鲜美（r.w.kerriganetal.1999），目前絮缘蘑菇文献较少，且多涉及系统分类，在生物学特性及栽培驯化方面鲜见报道。因此本实验对絮缘蘑菇进行组织分离和生物学特性系统研究，旨在为祁连山蘑菇属资源的保护利用提供理论基础。

技术实现要素：

本发明提供一种蘑菇属真菌絮缘蘑菇(agaricussubfloccosus)菌株。

本发明提供的絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus），来自野生絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus）lqq20171008005，其保藏号为cgmccno.18159。

本发明还提供了一种栽培所述絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus）lqq20171008005cgmccno.18159的方法，包括将所述絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus）lqq20171008005cgmccno.18159用于培养蘑菇的培养基中培养的步骤，具体如下：

先扩繁絮缘蘑菇的菌丝，得到母种；再将所述母种进行原种培养，得到原种；再将原种在栽培料上培养，得到栽培种，然后覆土出菇，实现絮缘蘑菇栽培；

上述方法中的培养基为：

菌丝培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蛋白胨1g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁2g、水1000ml；

原种培养基配方：500g/瓶、麦粒97％、石膏粉1％、碳酸钙1.5％、121℃下高压灭菌2小时；

栽培料配方：500g/袋、木屑79%、高粱籽5%、玉米面5%、石膏1％，121℃下高压灭菌2小时；

菌丝培养条件：16-18℃避光培养30天；

原种培养条件：16-18℃下避光培养60天；

栽培料培养条件：16-18℃下避光培养90天；

出菇培养为：栽培料覆土3-5cm，栽培袋封口继续培养，温度14-18℃，待原基出现后1周开袋出菇，温度15-20℃；

所述絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus）lqq20171008005cgmccno.18159在制备食品中的应用；

所述絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus）lqq20171008005cgmccno.18159在制备药品中的应用；

所述絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus）lqq20171008005cgmccno.18159在制备保健品中的应用；

所述絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus）lqq20171008005cgmccno.18159在培育可食用絮缘蘑菇中的应用；

絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus）于2019年09月2日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌株保藏编号为cgmccno.18159，分类命名为絮缘蘑菇(agaricussubfloccosus)。

本发明的有益效果在于：

本发明对野外采集标本，人工驯化后的栽培菇及菌株进行了形态学和基于真菌通用条形码基因its序列的分子生物学分析，鉴定该菌为絮缘蘑菇。在对絮缘蘑菇的驯化栽培中，发现絮缘蘑菇菌丝生长速度快，菇体口感好，是一个具有可开发价值的食用菌，对絮缘蘑菇的研究与开发对保护我国野生种质资源和食用菌遗传育种都有着重要意义。

附图说明

图1为野外采集的絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus）宏观形态特征。

图2为人工栽培的絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus）宏观形态特征。

图3为人工栽培条件下不同生长时期絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus）（菌种保藏号cgmccno.18159）的形态特征。a菇体的原基形成；b-d人工栽培形成的子实体。

图4为絮缘蘑菇(agaricussubfloccosus)的菌落及微观形态特征a培养性状；b孢子，c-f担子，g侧生囊状体，h菌髓。

图5为基于its1-5.8s-its2序列最大似然法（ml）分析的伞菌属系统发育树；

其中序列mn503475自野生标本lqq20171008005；序列mn510483来自野生标本分离的菌株cgmccno.18159；序列mn510484来自人工驯化后的菇体。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1.

絮缘蘑菇可种植种的获得

一、标本分离与鉴定

1.野外标本分离

野生标本于2017年10月采自甘肃省张掖市肃南县祁连山国家自然保护区（海拔2680m），标本采集号为lqq20171008005。

采用组织分离法分离菌种：野外采集絮缘蘑菇的子实体菌盖和菌柄交接处组织，无菌环境下置于装有pda培养基的试管培养基斜面上，16℃避光培养，得到絮缘蘑菇菌丝，通过纯化，即得到菌种。

pda培养基：取新鲜马铃薯200g切到1cm大小块状，加入1l蒸馏水煮30min后过滤、定容至1l，加入葡萄糖20g、琼脂18g。

2.标本鉴定

1)形态学鉴定首先观察其子实体的组成部分及其形态特征

用解剖刀纵切野外采集新鲜蘑菇（lqq20171008005）的子实体观察其菇盖组成、菌肉的颜色、质地、菌褶形状和着生情况、菌柄的组成，菌柄的质地，中实或中空等特征；

显微形态观察：取一块野外采集新蘑菇的菌褶放在清洁的载片中央，加一滴10％刚果红染色剂，1min后用吸水纸将染色剂吸干，加入5％氢氧化钾水溶液制成镜检材料，用镊子加盖玻，注意避免产生气，在光学显微镜下观察其微观特性。

结果如图1、2、3和4所示：野生担子果单生（图1），人工栽培条件下单生或双生（图2、3），鲜菇有蘑菇香味，子实体中等大，菌盖4-7cm，初半球形，子实体成熟后菌盖逐渐平展，中央略凹陷，白色略带浅棕色，不光滑，有片状鳞片，边缘内卷，有齿轮状鳞片，直径为4-7cm（图2‐c、d），菌盖菌肉白色，伤变浅粉色；菌褶1-3mm，离生，不等长，菌褶密，幼时粉红色，成熟时褐色；菌柄近圆柱体，（4.2-8.5）×（0.5-1.5）cm，白色，菌柄肉有韧性；菌环单层，白色，膜质，生菌柄中上部；显微特征，孢子卵圆形，（5-7.5）μm×（3.75-5.5）μm，光滑，无色（图4-b）；担子棒状，（17.5-27.5）μm×（5.5-8.5）μm，棒状，小梗4个，多为4个担孢子（图4-c-f）；子实层体有侧生囊状体，棒状，（8.5‐14.8×4.3‐6.8）μm，无色，（图4‐g）；菌髓直径（22.5-52.5×52.5-85）μm，边缘（22.5-42.5×40-55）μm（图4‐h）。

2)分子系统学分析

实验室dna提取：本实验中将野外采集标本lqq20171008005，野外获得菌株（保藏号cgmccno.18159）、人工栽培的子实体采用ctab法提取dna，利用its1（5′‐tccgtaggtgaacctgcgc‐3′）和its4（5′‐tcctccgcttattgatatgc‐3′）通用引物进行pcr扩增。

pcr反应体系（25）μl：1μldna模板、2μldntp、1μlits1、1μlits4、2×taqpcrmastermix（200mdntp、4.0mmmgcl2、2.5utaqdna聚合酶）、ddh2o补齐。扩增程序为95℃预变性5min，然后95℃变性60s、50℃退火60s、72℃延伸60s，35个循环，最后一个循环72℃延伸10分钟，pcr扩增产物由北京擎科测序生物公司进行测序。

来自野生标本、菌丝cgmccno.18159及人工驯化后的菇体的its序列均一致（如序列1所示）。根据构建的伞菌属系统发育图谱（图5），它们与已报道的絮缘蘑菇在一个系统发育分支里，并获得0.95的后验概率支持率，研究结果支持它们为同一物种絮缘蘑菇。

经过上述鉴定，来自野生蘑菇lqq20171008005的菌株（即菌丝体），于2019年08月29日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），菌株保藏编号为cgmccno.18159，分类命名为絮缘蘑菇（agaricussubfloccosus）。

实施例2.

絮缘蘑菇生物学特性

（1）不同碳源对菌丝生长的影响以无碳培养基为空白对照，以6种碳源培养基（蔗糖、麦芽糖、甘露醇、甘油、可溶性淀粉和葡萄糖）为处理组,每个处理5个重复。用打孔器从菌种培养基同一半径处打孔取菌块，接种在6个碳源培养基上，恒温培养，十字交叉法在相同时间段内测量菌丝生长长度，当有一个处理菌丝长满时，整个实验停止培养，每个处理5个重复。

（2）不同氮源对菌丝生长的影响以无碳培养基为空白对照，以6种氮源培养基（硫酸铵、尿素、硝酸钾、酵母粉、硝酸铵和蛋白胨）为处理组。其他操作同碳源影响实验。

（3）不同无机盐对菌丝生长的影响以无无机盐培养基为空白对照，以6种不同无机盐（硫酸铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、硫酸镁和硫酸钙）为处理组。其他操作同碳源影响实验。

（4）不同ph对菌丝生长的影响设置6个ph梯度（5、6、7、8、9、10），其他操作同碳源影响实验。

（5）不同温度对菌丝生长的影响设置6个温度梯度（16℃、18℃、22℃、24℃、26℃、28℃），其他操作同碳源影响实验。

（6）不同维生素对菌丝生长的影响以无维生素培养基为空白对照，以6种不同维生素（vb1、vb2、vb3、vb6、vb12、vb复合）为处理组，其他操作同碳源影响实验。

（7）正交实验：在单因素实验的基础上，挑选出对絮缘蘑菇菌丝生长影响较大的3个因子。选用l9(3⁴)正交表，对菌丝生长较为显著的最佳碳源、无机盐、ph为直接因素进行三因素三水平的正交实验，在16℃下恒温培养，每个处理重复9次，其它操作和记录数据与碳源筛选实验相同。

表1不同单因素条件对絮缘蘑菇菌丝生长的影响

注：“++++”表示菌丝生长快、旺盛、茂密、浓白，“+++”表示菌丝发黄、生长一般长势好，“++”表示菌丝生长较慢稀疏，“+”表示菌丝不生长。同一列的小写字母表示在0.05水平上的差异性，大写字母表示在0.01水平上的差异性。

由表1得知絮缘蘑菇菌丝在6种不同的碳源均能生长，菌丝在蔗糖培养基生长最快，在甘油培养基生长最慢，综合菌丝长势和生长速度，最适碳源为蔗糖；絮缘蘑菇菌丝在不同氮源培养基都可以生长，在硝酸钾和蛋白胨培养基的菌丝生长最快，尿素培养基的菌丝生长最慢，综合菌丝长势和生长速度，最适的氮源为硝酸钾；絮缘蘑菇菌丝在除硫酸锰外其他无机盐培养基均能生长，菌丝浓白，在硫酸镁培养基菌丝生长最快，长势好，综合以上最适合无机盐为硫酸镁；在ph大于8时对菌丝生长起抑制作用，ph=6时菌丝浓白、生长快、长势最好，综合以上认为最适菌丝生长的ph=6；絮缘蘑菇菌丝在不同维生素培养基上均能生长，在维生素vb12培养基生长速度最快，在维生素vb3培养基生长速度最慢，综合以上最适维生素为vb12；在温度为16℃时菌丝浓白、生长最快(0.153cm/d)。

通过3因素3水平的正交分析表直观分析（表2）可见，碳源的极差最大，r=0.50，其次是无机盐和ph。综合考虑，确定了最佳配方，碳源a3，无机盐b2，生长因子c1，即蔗糖25g、硫酸镁2g、ph=5。对正交实验结果进行方差分析（表3），碳源的f值最大，其次是无机盐和ph。因此3因素的显著性差异由大到小依次是碳源>无机盐>ph，这与直观分析结果一致。

表2絮缘蘑菇菌丝生长的正交实验结果的直观分析

注：数据为6次的平均值和标准差；kn表示以n为水平上菌丝平均生长速度，r为极差。“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”表示菌丝长势依此增强。

表3絮缘蘑菇菌丝生长的正交实验结果的方差分析

r方=.998（调整r方=.990）

实施例3

絮缘蘑菇可种植种的人工栽培

一、培养基配制

菌丝培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁2g，水1000ml；

原种培养基配方：500g/瓶，麦粒97％，石膏粉1％，碳酸钙1.5％，121℃下高压灭菌2小时；

栽培料配方：500g/袋，木屑79%，高粱籽5%，玉米面5%，石膏1％，121℃下高压灭菌2小时；

二、栽培方法

1.母种扩繁：从实施例1的离心管斜面挑取少许絮缘蘑菇（cgmccno.18159）菌丝，置入装有pda培养基的18×180试管，16℃避光培养30天，得到扩繁后菌丝。

2.接种栽培

待菌丝在试管长满后，切成小块接种于原种培养基中，16℃下避光培养60天，将长满菌丝的原种接种栽培料，16℃下避光培养90天满袋，覆土3-5cm，置于人工智能气候培养室内培养,温度为14℃，空气湿度60％，待原基出现后1周开袋出菇培养，出菇温度14℃，湿度85%。

结果显示，实施例1获得的絮缘蘑菇菌株可以在以木屑、棉籽壳为主料，玉米面、石膏、磷酸二氢钾为辅料的聚丙烯袋装的栽培料上正常生长发育，麦粒原种接种60d长满瓶，栽培种接种约90d左右长满袋，长满后覆土培养20-30天出现原基，原基分化后2周开始摘鲜菇，从接种原种到子实体采收135d，得到人工栽培絮缘蘑菇子实体。

实施例4

絮缘蘑菇的食用性

将上述二得到的人工栽培絮缘蘑菇鲜菇清香，炖汤、清炒均味道鲜美，口感好，煎炸食用，有韧性，口感好。因此，本发明提供的絮缘蘑菇(agaricussubfloccosus)lqq20171008005、cgmccno.18159具有食用性，可开发为人工栽培食用菌。

序列表

<110>河西学院

<120>一种野生新食用菌的分离及其人工驯化栽培方法

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1633

<211>dna

<212>絮缘蘑菇(agaricussubfloccosus)

<400>1

ttggcataggatatgttttctagatgggttgtagctggctcttcggagcatgtgcacacctgtttggacttcattttcatccacctgtgcaccttttgtagtctttcaggtattgaaggaagtggtcagcctatcagctctttgctggatgtaaggacttgcagtgtgaaaacagtgctgtcctttaccttgaccatggactctttttcctgttagagtctatgttattcattatactcttagaatgtcattgaatgtctttacatgggctatgcctatgaaaattattatacaactttcagcaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcatcttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcattatattctcaactccccaataccttgttgtaaaggagagcttggattgtggaggtttgctggcccctgcttggggtcagctcctctgaaatgcattagcggaaccgtctgcgatctgccacaagtgtgataacttatctacactggcgaggggattgctttctgtgatgttcagcttctaatcgtctaaggacaaattcttgaatgcttgacctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaataagcggagga

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<120>一种野生新食用菌的分离及其人工驯化栽培方法

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