转录因子OsTBP2.1的应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，涉及突变的基因osnrt2.3启动子及其应用。

背景技术：

启动子是基因的重要组成部分，它的主要功能是控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”，决定基因的活动。

然而，如果一个基因的启动子或者转录序列发生snp，所启动基因的表达程度会因此而受到影响，从而会影响到植物的生长。(huangz,ganz,hey,etal.functionalanalysisofaricelatepollen-abundantudp-glucosepyrophosphorylase(osugp2)promoter[j].molecularbiologyreports,2011,38(7):4291-4302.vandanaj,vijayg,salonim,etal.identificationofnovelsnpinpromotersequenceoftagw2-6aassociatedwithgrainweightandotheragronomictraitsinwheat(triticumaestivuml.)[j].plosone,2015,10(6):e0129400-.)有研究表明，控制基因转录的关键作用位点发生突变会降低对非生物胁迫的抗逆性。(leebh,maitt,songjt,etal.thearabidopsisthalianangatha1transcriptionfactoractsasapromoterofageneraldifferentiationprogramandacarpelidentityfactor[j].journalofplantbiology,2017,60(4):352-357.)

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种含水稻基因ostbp2.1的重组表达载体以及在水稻中的应用。

本发明还发现了能与osnrt2.3启动子关键位点结合的转录因子，ostbp2.1。

本发明另一个目的是提供了该转录因子的orf和氨基酸序列。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

转录因子ostbp2.1在提高水稻的产量中的应用；所述的水稻基因ostbp2.1的orf序列为seqidno.1，氨基酸序列为seqidno.2。

作为本发明的一种优选，超表达转录因子ostbp2.1以提高转基因水稻产量。

一种重组表达载体，含有水稻基因ostbp2.1；所述的水稻基因ostbp2.1的orf序列为seqidno.1，氨基酸序列为seqidno.2。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的重组表达载体的出发载体为ptck303载体。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的重组表达载体中所述的水稻基因ostbp2.1通过相应酶切位点到ptck303载体上。

本发明所述的重组表达载体在提高水稻的产量中的应用。

有益效果：

1.本发明公开水稻基因ostbp2.1超表达后提高了水稻的产量以及改变了osnrt2.3a/b的表达模式。(图1和图2)

2.本发明公开水稻蛋白ostbp2.1与基因osnrt2.3启动子83bp关键位点相结合。(图3)

3.

附图说明

图1：ostbp2.1超表达和突变体田间表型及ostbp2.1和osnrt2.3a/b的表达

(a)ostbp2.1超表达和突变体田间表型

(b)ostbp2.1超表达和突变体ostbp2.1和osnrt2.3a/b的表达

图2：ostbp2.1超表达和突变体的产量

图3：酵母单杂验证蛋白ostbp2.1和osnrt2.3启动子关键位点关系

aba表示金担子素

具体实施方案：

实施例1-83bp(osnrt2.3编码区前(即atg前)83bp)突变的获得及鉴定

1)总rna的提取

水稻(日本晴)幼苗长至3叶期，立即取叶迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右叶，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入1mltrizol试剂(购自invitrogen,usa)，充分摇匀振荡后，抽提总rna。

2)ostbp2.1基因全长的克隆及超表达载体的构建

通过ncbi网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因数据库中检索到水稻的ostbp2.1(ak108240)基因的启动子，用软件primer5.0设计引物序列(如下)，从水稻基因cdna中扩增ostbp2.1基因编码序列。

p1:5’-atggctgccgcggcggtgga-3’(seqidno.3)

p2:5’-tcagcgctgctgagttttcc-3’(seqidno.4)

以步骤1)获得的总rna为模板，经反转录合成cdna第一链后，以其为模板，用高保真酶(primestarhsdnapolymerase购自takara公司)进行pcr扩增，pcr程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pmd-19载体(购自takara公司)，测序正确后就获得具有完整编码区的水稻基因ostbp2.1序列(seqidno.1)。将得到的基因ostbp2.1序列通过同源重组的方法构建到ptck303表达载体上。

3)基因ostbp2.1超表达和突变体材料的获得

将得到的pubi::ostbp2.1的表达载体通过农杆菌介导的方法转入到水稻中；其突变体则是t-dna插入的突变体，通过二轮pcr鉴定得到纯合株系并进行下一步生物学实验。在得到超表达和突变体株系后鉴定其基因ostbp2.1以及osnrt2.3a和osnrt2.3b的表达效果；并且在田间测其单株产量，以观测基因ostbp2.1对水稻生长发育以及其他基因表达的影响。

结果见图1和图2。

4)酵母单杂系统验证

按照clontech公司的goldyeastone-hybridlibraryscreeningsystemusermanual的使用说明进行操作。

诱饵序列为：tttccgctatgctataagagctgac(osnrt2.3编码序列前83bp处)，结果见图3。

序列表

<110>南京农业大学

<120>转录因子ostbp2.1的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>627

<212>dna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>1

atggcggcggcggaggcggcggcggaggcggcggcggcgctggaggggagcgagcccgtg60

gacctggtcaagcacccctccggcatcatccccacgctccaaaacatcgtgtcgacggtc120

aatttggattgcaaattagacctcaaagctatagctttgcaagcacgcaatgcagaatat180

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atatttgcatcgggtaaaatggtatgtactggggcaaagagcgaacaacaatcaaagctt300

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<210>2

<211>208

<212>prt

<213>水稻(oryzasativa)

<400>2

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151015

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202530

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180185190

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195200205

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

atggctgccgcggcggtgga20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tcagcgctgctgagttttcc20