大豆角共生固氮脂多糖基因或其蛋白与应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及大豆角共生固氮脂多糖基因或其蛋白与应用。

背景技术：

大豆(glycinemax)等豆科作物与其它经济作物相比，具有一种特有的农艺性状——可以与匹配的土壤根瘤菌相互作用，形成根瘤，将空气中的氮气转化成可以直接吸收的铵。根瘤所固定的氮不仅可为宿主植物提供氮素营养，还能改良土壤，减少化肥投入。qinl等指出，在我国东北地区，减施50％氮肥的同时接种高效根瘤菌，比常规施肥增产大豆20％以上。可见，将根瘤菌接种技术应用于农业生产，充分发挥生物固氮作用，是大豆减肥增产的重要策略之一。因此，研究大豆共生固氮的规律并且将其应用于生产实践，对于提高国产大豆竞争力以及解决农业氮源污染具有重要意义。

目前的研究表明，根瘤的形成过程为：聚集在豆科植物根毛顶端的根瘤菌分泌纤维素酶，从而将根毛细胞壁溶解以便土壤中的根瘤菌从根毛尖端侵入根的内部，在根的皮层细胞内大量繁殖。在根瘤菌侵入的刺激下，根细胞分泌一种纤维素，将感染丝包围起来，形成一条分枝或不分枝的纤维素鞘，叫做侵入线。侵入线不断地延伸，直到根的内皮层。根的内皮层处的薄壁细胞，受到根瘤菌分泌物的刺激，产生大量的皮层细胞，从而使该处的组织膨大，最后形成根瘤。随着根瘤的形成和增大，根瘤菌在根瘤细胞内继续不断分裂繁殖，使得根瘤细胞的细胞质和细胞核逐渐解体，最后几乎全部占领根瘤细胞。

刘向东的调查研究称：wan等应用蛋白质组学技术检测了大豆根与根瘤菌的相互作用，萌发4d的幼苗经b.japonicum野生型菌株和nodc突变体菌株处理后，收集根和根毛，用水处理过的幼苗来对比，根与根毛的蛋白质组图谱比较显示，有96个蛋白表达差异，其中，共有12个蛋白是根毛中特有的。经maldi-tofms分析，一共鉴定出23个蛋白，其中几丁质酶i和胁迫诱导基因h4是根毛特有。另一方面，对照与b.japonicum野生型菌株处理的根毛采用nanolc-q-tofms/ms分析后差异表达的有16个蛋白点，其中，脂氧合酶、苯丙氨酸解氨酶和抗坏血酸过氧化物酶都是已知的对处理有反应的蛋白；也有一些是新鉴定出的。例如，肽链内切酶clpatp-结合酶、磷脂酶d、泡状融合酶和伴侣蛋白。10个蛋白在野生型菌株与突变体菌株处理的根毛中有表达量的变化，这组蛋白中包含一些已知的蛋白，一些新蛋白的鉴定还需要nodc-功能表达分析。panter等分离出大豆根瘤中环形细菌的膜蛋白，共获得17个膜蛋白的蛋白质数据，其中有6个蛋白质是已知功能的同源蛋白。hoale等比较大豆根瘤和根线粒体的蛋白，在根线粒体中检测到特异蛋白，其中差异表达的蛋白参与根瘤的代谢。sarma等研究大豆和土壤细菌间的共生固氮过程，利用双向电泳技术分离类菌体蛋白，证明类菌体在氮、碳代谢中表达了一个主要的、精细的蛋白网络。larrainzar等确定了377个根瘤蛋白。nathan等分析大豆根瘤细胞液，鉴定了69个蛋白，包括28％碳代谢，12％氮代谢，12％活性氧代谢蛋白，这些蛋白都参与了共生固氮作用。

脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharidebindingprotein，lbp)是一种糖蛋白，在动物中，脂多糖结合蛋白作为脂多糖的载体，与脂多糖中类脂a高度亲和，从而引起一系列的炎症反应，但此前，并没有关于脂多糖结合蛋白对豆科植物共生固氮作用存在影响的相关报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供大豆角共生固氮脂多糖基因或其蛋白的用途，本发明通过研究表明，gmlbp1基因或蛋白能够调节根瘤数量，且不影响植株的生长，也不参与调控根固氮酶的活性。

本发明提供了如下i)～v)中的至少一种在调控植物根瘤数量中的应用，

i)、gmlbp6蛋白；

ii)、gmlbp6蛋白的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与gmlbp6蛋白具有相同或相近功能的蛋白；

iii)、编码i)或ii)所述蛋白的核酸分子；

iv)、在iii)所述核酸分子的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同或相似功能蛋白的核酸分子；

v)、能够调控i)～v)中的至少一种的水平或活性的物质。

本发明中，所述gmlbp6蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示；

编码seqidno:1所示蛋白的核酸分子的序列如seqidno:2所示。

本发明中，所述植物为豆科植物；本发明中用以验证gmlbp6功能的植物为豆科植物大豆，具体为大豆williams82。

本发明还提供了增加植物根瘤数量的制剂，其包括如下i)～vi)中的至少一种：

i)、敲除或敲低gmlbp6基因的表达载体；

ii)、含有i)的重组宿主；

iii)、干扰gmlbp6基因表达的核酸分子；

iv)、gmlbp6基因表达的终止子或转座子；

v)、抑制gmlbp6基因转录的制剂；

vi)、gmlbp6蛋白活性抑制剂。

本发明提供的制剂在提高植物固氮能力中的应用。

豆科植物的根瘤中共生的根瘤菌能够将空气中游离态的氮转化为含氮化合物供给给豆科植物，根瘤数量的增加意味着共生根瘤菌数量的提高，有利于固氮作用的进行，从而有利于增加氮素来源，减少化学氮肥的施入，降低土壤板结。本发明提供的制剂能够敲除或敲低gmlbp6基因的表达、干扰gmlbp6基因转录、降低植物内源gmlbp6蛋白的水平和/或活性，因此能够增加根瘤菌的数量从而提高植物固氮能力。

本发明所述敲除或敲低gmlbp6基因的表达载体，是指可以用于破坏原来基因的结构，使其失去活性，或者去除掉内源gmlbp6基因的表达载体。其可以通过同源重组的方式来改变基因结构。本发明中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述的宿主可为真菌、细菌、藻类或细胞。

所述干扰gmlbp6基因转录的核酸分子能够通过阻碍gmlbp6基因的翻译或转录来抑制基因表达，本发明中，其可为靶向gmlbp6基因的sirna。

本发明还提供了一种提高植物固氮能力的方法，其以本发明所述的制剂，敲除或敲低gmlbp6基因的表达、干扰gmlbp6基因转录、降低植物内源gmlbp6蛋白的水平和/或活性。

本发明还提供了一种预测植物根瘤数量多少的制剂，其包括：

检测gmlbp6基因转录水平的制剂；

和/或检测gmlbp6蛋白的表达水平或活性制剂。

本发明所述的制剂在鉴定植物固氮能力中的应用。

本发明还提供了鉴定植物固氮能力的方法，其以本发明所述的制剂检测植物种质的gmlbp6基因转录水平或检测gmlbp6蛋白的表达水平或活性。

本发明所述检测包括表达量或活性水平的检测。例如，对gmlbp6蛋白表达水平的检测采用westernblot的方法；对gmlbp6基因转录水平的检测采用real-timepcr的方式。利用本发明所述的鉴定方法，仅对植物幼嫩组织进行检测就可实现对该种质固氮能力的预测，缩短育种周期。

本发明还提供了gmlbp6-5蛋白突变体，其第38位氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸。野生型gmlbp6蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。

编码本发明所述突变体的核酸分子。作为优选，编码本发明突变体的核酸分子其序列如为在如seqidno:2所示的序列中，第114位碱基由t突变为c。

本发明还提供了含有编码本发明所述突变体的核酸分子的质粒载体，以及含有该质粒载体的重组宿主。

本发明还提供了，上述突变体或核酸分子在提高植物固氮能力、预测植物根瘤数量和/或鉴定植物固氮能力中的应用。

上述提高植物固氮能力是指使植株或种质材料中的gmlbp6蛋白发生突变，形成本发明所述的突变体。本发明所述预测根瘤数量和/或鉴定植物固氮能力，是指鉴定gmlbp6蛋白是否发生了突变，或者鉴定gmlbp6基因是否发生突变。

因此，本发明还提供了预测根瘤数量和/或鉴定植物固氮能力的试剂，其包括鉴定gmlbp6基因突变位点的试剂。

本发明研究表明，大豆角共生固氮脂多糖基因突变，导致突变体的根瘤数比野生型的根瘤数显著增多，而对突变体进行gmlbp6基因的过表达则使根瘤数目恢复至与野生型一致。利用gmlbp6作为标志物，能够实现对植物种质，特别是大豆种质固氮能力的早期鉴定。

附图说明

图1.显示了本发明大豆gmlpb6基因的基因组序列，其中粗体表示外显子序列，斜体表示内含子序列，表示启动子，表示终止子；

图2.显示了大豆gmlbp6-5突变体较williams82叶片轻微黄化，无其他表型差异；

图3.显示了大豆gmlbp6-5突变体较williams82根瘤数目增多，a和b为gmlbp6-5突变体较williams82根瘤数目增多，c和d为接种根瘤菌后gmlbp6-5突变体较williams82根瘤数目增多；

图4.显示了豆gmlbp6-5突变体和williams82根瘤数目和固氮酶活性，a为gmlbp6-5突变体较williams82根瘤数目增多13倍，接种根瘤菌后gmlbp6-5突变体较williams82根瘤数目增多2倍，bgmlbp6-5为突变体形成根瘤的固氮酶活性与野生型比较无显著性差别；

图5示pcambia3301h-lbp6过量表达载体图谱；

图6示转基因植株的表型得到恢复；

图7示转基因植株的根瘤数量与野生型对照一致。

具体实施方式

本发明提供了大豆角共生固氮脂多糖基因或其蛋白与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

所述编码gmlpb6蛋白的核酸分子包括编码gmlpb6蛋白的基因组dna、cdna、重组dna或mrna、hnrna；或者与上述dna、cdna、重组dna或mrna呈反向互补的核酸分子。

上述核酸分子可根据实际需要进行修饰或优化，从而使基因表达更高效；例如，①可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述gmlpb6基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合受体植物的偏爱性。②或修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰。③与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；④引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于tmv、mcmv和amv)。

对于不含有gmlpb6的植物，可采用化学法、鸟枪法、微注射，电穿孔等方法，将gmlpb6的基因片段导入植物细胞，也可通过同源重组、锌指核酸酶、talen、crispr等方法将gmlpb6的基因片段导入植物细胞。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1.大豆中gmlbp6基因的分离和结构分析

(1)基因的分离

从大豆品种——williams82幼嫩叶片中,分离mrna,以此mrna为模板,以oligo(t)17为引物合成cdna第一条链。接着以该cdna第一条链为模板，引物(5’-atggcaccctcaattgttttg-3’)和引物(5’-ttatgaaacataagctaact-3’)进行pcr扩增，获得了1个gmlpp6基因的长为1482bp的cdna片段，克隆到pgemteasy载体(takara公司)中并命名为pgemteasy-gmlbp6。

pgemteasy-gmlbp6中所包含gmlbp6cds序列如seqidno:2所示，共1482bp，它编码一个493个氨基酸的蛋白(seqidno:1)。

(2)基因的结构分析

以williams82幼嫩叶片为材料，提取其中的dna，接着以该基因组dna为模板，扩增获得了gmlbp6基因组的片段，gmlbp1dna序列如seqidno:3所示，共5696bp，它含有5个内含子和6个外显子(如图1)。

实施例2.大豆gmlbp6基因不影响植株生长

以williams82为背景，我们建立了大约包含5000个株系的tilling群体。利用此平台，我们筛选了1200个株系共找到了15个碱基变化的突变株系,经鉴定，其中6个株系的lbp6蛋白氨基酸发生错义突变，在lbp6-5突变体中，lbp6蛋白的第38亮氨酸改变为脯氨酸。该位置是bpi结构域中非常保守的氨基酸，所以我们首先选取lbp6-5进行后续实验。通过检测接种根瘤菌前后植株生长形态，发现无论是否接种根瘤菌，gmlbp6-5突变体相比于williams82野生型叶片稍微偏黄色，株高等其他表型无差异(图2)。

实施例3.大豆gmlbp6基因调控根瘤数量

(1)大豆gmlbp6基因调控根瘤数量

无论是否接种根瘤菌，gmlbp6-5突变体的根瘤数比williams82野生型的根瘤数多，并且在未接种根瘤菌的情况下，gmlbp6-5突变体根瘤数是williams82野生型根瘤数的13倍，接种根瘤菌的情况下，gmlbp6-5突变体根瘤数是williams82野生型根瘤数的2倍多(图3)。

(2)大豆gmlbp6基因调不参与控根固氮酶活性

虽然接种根瘤菌以后，gmlbp6-5突变体比野生型形成了更多的根瘤(前者是后者的2倍以上)。但是，该突变体形成根瘤的固氮酶活性与野生型比较无显著性差别(图4)。由此我们推测lbp可能参与调节根瘤发育。

(3)gmlbp6过量表达载体的构建和转基因植株的获得

提取大豆williams82根的总rna，反转录成cdna，以反转录成的cdna为模板，扩增得到gmlbp6基因，利用bamhi和smai酶切纯化后的pcr产物，然后将酶切片段连入pcambia3301h双元载体中(图5)，测序正确后用于大豆转化。

为了研究大豆lbp基因的功能，利用农杆菌介导的半种子法转化大豆，再生出转基因植株。对已获得转基因植株繁种至t2代，进一步分析了lbp6过量表达植株的结瘤固氮表型。转基因植株的表型得到恢复，根瘤数目与野生型对照一致(图6～7)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>大豆角共生固氮脂多糖基因或其蛋白与应用

<130>mp1926531

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>493

<212>prt

<213>大豆(glycinemax)

<400>1

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151015

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