一种宏基因组绝对定量的方法与流程

本发明涉及宏基因组绝对定量的方法。
背景技术：
：目前16s和宏基因组测序研究中，菌群的数量和结构主要通过相对丰度来表示，然而基于相对值的菌群分析方法局限性较大。因此，实现对单个菌株或者目标基因的绝对定量，对于研究菌群功能具有十分重要的意义。在绝对定量的过程中，不同样品(如粪便或土壤样本)之间、甚至同一样品的多个重复之间dna提取得率的差异同样也会显著影响目标菌株的绝对定量结果。技术实现要素：本发明通过分别在粪便样本基因组dna(genomicdna,gdna)提取前和提取后加入两段已知长度、序列和准确质量的标准品dna片段(sdna1和sdna2)；通过一系列计算方法，结合提取gdna所用的粪便质量，最终得出单位质量粪便中细菌的分子数。本发明的方法无需进行qpcr定量或者流式细菌计数，操作简单易行且实验成本低。本发明提供了一种细菌定量的方法，包括：在样品中添加第一定量dna片段；对所述样品进行基因组dna的提取；在所述提取的基因组dna中添加第二定量dna片段，得到总基因组；对所述总基因组进行宏基因组文库构建和测序；利用得到的测序结果的数据计算单位质量的所述样品中的细菌数量。在上述方法中，其中，所述样品为粪便样品。在上述方法中，其中，所述第一定量dna片段的序列为序列1。在上述方法中，其中，所述第二定量dna片段的序列为序列2。在上述方法中，其中，所述样品中的所述第一定量dna片段的分子数为：测序所得的所述第一定量dna片段的拷贝数与单位质量的所述样品中加入的所述第二定量dna片段的分子数的乘积再除以测序所得的所述第二定量dna片段的分子数。在上述方法中，其中，所述样品中的基因组dna的得率为：单位质量的所述样品中的所述总基因组中的所述第一定量dna片段的分子数除以加入的所述第一定量dna片段的分子数，之后再乘以所述样品中的基因组dna的总量。在上述方法中，其中，单位质量的所述样品的细菌的数量为：单位质量的所述样品中加入的所述第二定量dna片段的分子数、测序所得的细菌的总拷贝数和所述样品的基因组dna的总量的乘积，再除以测序所得的所述第二定量dna片段的拷贝数、所述样品中的基因组dna的得率和所述样品的质量的乘积。本发明不用针对粪便样本进行流式细菌计数实验，极大节省了该方面的实验成本及时间。通过在提取后的粪便样本gdna后加入sdna2(已知序列、相对分子质量以及加入量，可得出其准确分子数)，不用针对该片段进行专门的qpcr实验进行定量，同样极大节省了该方面的实验成本及时间。另外，sdna1和sdna2片段均来自植物基因组，与细菌的参考基因组序列无同源性；此外，本发明的方法中采用的是宏基因组测序，获得的菌群数据信息相比16s测序更全面准确。附图说明图1示出了本发明的方法的流程的示意图。图2示出了本发明的结果的计算方法的示意图。具体实施方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。为了提高例如粪便样本中的目标菌株的绝对定量结果的准确性，一种方法是利用流式细胞仪检测粪便样本中细菌细胞的个数，之后结合16s测序获得的肠道菌群丰度数据，实现对菌群的绝对定量；另一种方法则是通过向样品dna中添加一定量外标序列，进行16s扩增子文库构建、测序，再根据外标序列的16s扩增子读数及其绝对拷贝数绘制标准曲线，计算出样品中操作分类单元(otu)代表序列对应物种16srrna基因绝对拷贝数。本发明通过分别在粪便样本gdna提取前和提取后加入两段已知长度、序列和准确质量的标准品dna片段(sdna1和sdna2)；其次，通过计算后加入sdna2片段的准确分子数，利用sdna2的分子数与其测序拷贝数的比值和sdna1分子数与其宏基因组测序数据分析得出的拷贝数比值相等：(1)计算出提取后sdna1的分子数，再与提取前加入的sdna1分子数相比，由sdna1的得率来代表粪便样本gdna的提取率；(2)用同样的方法，计算得出单位质量gdna样本中细菌分子数；最后，通过换算提取gdna所用的粪便质量，最终得出单位质量粪便中细菌的分子数。本发明的方法的大致流程如图1所示，本发明的结果的计算过程如图2所示。下面详细描述本发明的方法的具体操作流程，以更好地理解本发明。1.粪便样本gdna的提取本实验中选取了3例粪便样本进行测试，gdna提取所用的是perkinelmer粪便gdna提取试剂盒(cmg-1076chemagicdnastoolkit)，样本前处理完成后在perkinelmer自动核酸提取仪(pechemagic360)上完成粪便样本gdna的提取。(1)粪便样本前处理：a.从粪便样本品保存管(含dna保护液(主要成分是三羟甲基氨基甲烷(trisbase)；乙二胺四乙酸(edta)；氯化钠(nacl)～常温饱和；二甲基亚砜(dmso)；乙醇；甘油，具体请见申请号为201910327561.5的专利))中用阔口枪头吸取400μl粪便混悬液，装入2mlep管中，随后依次加入1000μl裂解液(包含50mmol/ltris-hcl；1.0mmol/ledta；150mmol/lnacl；0.1％sds)、30μl蛋白酶k、适量镐珠，10ngsdna1；b.放入组织研磨器60hz研磨60s；c.70℃金属浴恒温加热10mins，95℃金属浴恒温加热5mins；d.离心机最大转速(>15,000g)离心5mins；(2)样品盒加样a.样品盒2中加入600μl步骤(1)d中上清液、600μlbindingbuffer、600μl无水乙醇；b.样品盒3中每孔加入75μl磁珠；c.样品盒8中每孔加入200μl洗脱缓冲液(elutionbuffer，10mmtris-hcl和1mmedta溶液，ph8.0)；(3)自动核酸提取机器设定a.打开自动核酸提取机，打开紫外灯(uvlamp)提前消毒5-10mins；b.打开桌面chemical360.exe，待2-3mins后程序就绪完毕；c.打开隔离板，按照仪器指示位置依次放入1-8号样品盒；d.选择程序chemagicdnastool360wbprefillingdryingvd180907.che选择孔位置。(4)仪器结束工作后，打开隔离板，取出样品盒8，吸出提取好的gdna至洁净的1.5mlep管中，即为提取好的粪便样本gdna；妥善处理好使用过的样品盒后，检查机器无异常即关闭程序，关闭仪器。2.宏基因组文库的构建以及测序本实验中所使用的宏基因组建库试剂盒为华大智造生产的mgieasydna文库制备试剂盒，测序试剂盒为bgiseq-500rs高通量测序试剂套装(pe100)，测序在bgiseq-500rs测序仪平台上完成。(1)粪便样本gdna的质控、定量及sdna2的添加a.使用酶标仪对所提取的gdna进行浓度和质量(od260/280)检测，其中浓度小于10ng/μl，或od260/280值异常(od260/280>2.5,orod260/280<1.5)的样本则判定不合格，不进入标准品添加和建库实验环节；b.取2μlgdna进行琼脂糖凝胶电泳，15kdnamarker位置左右无明显主带或降解严重的样本则判定不合格，不进入标准品添加和建库实验环节；c.经质控合格的gdna样本，取2μg(根据a中的浓度计算体积)加入0.2ng的dna2(万分之一比例)，混匀；(2)宏基因组文库的构建a.取1μggdna样本，加入covarismicrotube(打断管)中，用te缓冲液将体积补至130μl，开启covaris打断仪，选择350bp片段的打断程序，进行超声打断；b.磁珠双选：提前30分钟取出ampurexp磁珠置于室温，使用前充分震荡混匀；先后加入0.6倍和0.2倍体积的磁珠，纯化打断后的gdna，获得峰值在350bp的片段；c.末端修复:在pcr管中配制反应体系(dna40μl；eratbuffer5μl；eratdntpmix0.6μl；eratenzymei0.6μl；eratenzymeii0.1μl；eratenzymeiii0.2μl；eratenzymeiv2μl；nfh2o1.5μl；总体系50μl)，混匀后在pcr仪上进行反应，程序如下：热盖on；37℃30mins；65℃15min；d.接头连接及反应产物纯化：向上一步反应液的pcr管中加入5μladaptermix，吹打混匀；反应混合液按组分比例添加(含adapter的dna55μl；ligationbufferi3μl；ligationbufferii16μl；ligationenhancer0.8μl；ligationenzyme1.6μl；nf水3.6μl；总体系80μl)，混匀后在pcr仪上反应，程序如下：热盖on；23℃60mins；反应结束后，取出pcr管，加入20μlte到pcr管中至体积为100μl，再加入50μlampurexp磁珠(0.5倍)至100μl连接产物中，获得44μl的纯化产物；e.pcr扩增及产物纯化：取44μl纯化后的连接产物，按组分配制反应体系(dna44μl；pcrenzymemix100μl；pcrprimermix12μl；nf水44μl；总体系200μl)，pcr反应体系如下：热盖on；95℃3mins；7个循环(98℃20s；60℃15s；72℃30s)；72℃10mins；反应完成后加入等体积的ampurexp磁珠进行纯化，获得30μl的纯化产物；f.文库质控：pcr产物纯化后可选用agilent2100bioanalyzer或者labchip检测pcr产物的长度和分布范围。要求pcr产物片段主带在450bp左右，无dimer、无其他污染；g.pcr产物环化及消化处理：使用dsdnahsassaykit试剂盒对纯化的pcr产物进行定量，等量混合所有的待测文库(总量为330ng)后，补充nfh2o到pcr管中至总体积为60μl，按照组分要求配制热变性反应体系(均一化后pcr产物60μl；splintoligo10μl；总体积70μl)，在pcr仪上95℃孵育3mins后立即冰上放置3mins；之后按组分要求配制环化反应混合液(热变性后pcr产物70μl；splintbuffer12μl；ligationenhancer1.2μl；ligationenzyme0.4μl；nf水36.4μl；总体积120μl)，pcr仪上37℃孵育60mins；反应完成后，按照组分要求配制消化反应体系(环化产物120μl；digestionbuffer0.8μl；digestionenzymei3.9μl；digestionenzymeiii1.3μl；nf水2μl；总体积128μl)，pcr仪上37℃孵育30mins；反应完成后加入15μldigestionstopbuffer震荡混匀5s终止反应，之后加入170μl试剂盒自带的librarypurificationbeads对产物进行纯化，最终获得40μl产物；(3)文库上机测序a.dnb(dnananoballs)的制备：取出上一步骤中环化好的文库，按照组分要求在0.2ml的pcr管中配制反应液(文库40fmol；dnb制备缓冲液20μl；补nfh2o至总体积40μl)，震荡5s混匀后置于pcr仪上进行反应，体系如下：热盖on；95℃1min；65℃1min；40℃1min；当pcr仪温度达到4℃时取出pcr管，迷你离心机离心5s后，在冰上将如下组分加入管中(dnb聚合酶混合液40μl；dnb聚合酶混合液ii4μl)；反应混合液用漩涡振荡器震荡混匀，迷你离心机离心5s后即刻置于pcr仪中开始反应，反应条件如下：热盖on(80℃)；30℃20mins；当pcr仪温度达到4℃后立即取出pcr管(切勿离心)，加入20μldnb终止缓冲液，用移液器和阔口吸头缓慢地吹打混匀5次，切勿震荡及剧烈吹打，放于4℃保存备用(48小时内使用)；b.dnb浓度的测定(质控)：dnb制备完成后，用ssdnaassaykit和fluorometer仪器进行浓度检测。浓度8ng/μl以上为合格，对浓度过低的dnb需重新制备；c.dnb的加载及处理：提前取出样本加载试剂板于室温融化后并放置好；检查全自动样本加载系统是否正常，并按仪器说明书放置好芯片，将dnb转移至适配的pcr管中，并加入dnb加载缓冲液ii32μl；dnb聚合酶混合液ii1μl；用阔口吸头温和混匀5-8次，将以上混合液放于加载系统指定dnb放置区，选择dnb加载程序sampleload2.0，点击开始，等待加载完成；加载完成后，保持芯片在室温孵育30mins待用；建议制备好的芯片应尽快安排上机测序，如果当天不能使用，请置于干净的pe手套内并平放于2-8℃冰箱中备用，有效期48小时；d.测序：取出pe100测序试剂槽i和pe100试剂槽ii室温融化后(约3h)，置于4℃冰箱备用；提前1h取出pe100dntps混合液和pe100dntps混合液ii，室温融化后置于4℃冰箱或者冰盒上备用；使用前取出pe100测序酶混合液，置于冰盒上备用；移取pe100测序酶混合液(3600μl)、pe100dntps混合液(1800μl)和pe100dntps混合液ii(1800μl)前，短暂离心后用移液器吹打混匀5次，加入到对应孔位中；依照bgiseq500-rs使用说明书，启动测序仪对应的内置控制程序；首先用清洗芯片进行仪器的流道清洗，以上预处理完成的pe100测序试剂槽i和pe100测序试剂槽ii按照孔位一一对应，并使用试剂盒iv的试剂槽盖板组装在一起，然后放入测序仪冰箱，参照bgiseq500-rs使用说明书进行试剂预载，之后安装芯片开始进行测序；mda试剂加载如进行单芯片测序，则待pe100测序进行在60-100cycles间加入试剂，如进行双芯片测序，则待pe100测序进行在80-100cycles间加入，仪器上界面会出现相应提示；测序完成以后，取出芯片和试剂槽，参照bgiseq500-rs使用说明书清洗测序仪。3.下机数据质控及分析(1)在此次测试实验中，使用了3个样本的数据，经过初步的处理，数据见下表1。表1(2)测序样本中标准品片段及细菌的拷贝数计算经过数据进一步比对到参考基因组上，通过软件计算得出菌群的拷贝数值见下表2。表2(3)测序样本细菌分子数的定量计算：测序样本单位质量粪便样本分子数计算结果见表3。表3项目kms1kms2kms3测序所得sdna2的拷贝数(copies)15.684960218.1512358619.48387097测序所得sdna1的拷贝数(copies)50.09312053174.132526127.07253715实际1μgdna样本中sdna1的分子数55391665.816638855924099247.05dna提取率0.0045471560.1274775420.0025409细菌拷贝数(copies)3.8668592314.4672514114.5481595571μgdna测序样本中细菌分子数100727582.14268585.2064048649.751400μl样本的dna提取总量(μg)6.912570.740675.38209400μl粪便提取的dna所含分子数1.53126e+1124801333.328575780792原采样管粪便质量(g)1.30.60.36原采样管粪便体积(ml)2.832400μl粪便样本的质量(g)0.1857142860.080.072每克粪便的细菌分子数(个/g)8.25e+113.10e+081.19e+11其中，sdna2加入1μgdna中的分子数为：17344019.78；sdna1在gdna提取时加入的分子数为1762239883，那换算到每提取1μgdna所加入的sdna1的分子数＝sdna1在gdna提取时加入的分子数/400μl样本的dna提取总量。从kms1和kms3这两个样本实际计算所得的单位质量的细菌数来看，与常规文献里所得的结果数量级相符(文献中报道的单位质量细菌分子数数量级在1010-1011，参考文献：vandeputte,d.,kathagen,g.,d'hoe,k.,vieira-silva,s.,valles-colomer,m.,sabino,j.,wang,j.,tito,r.y.,decommer,l.,darzi,y.,etal.(2017).quantitativemicrobiomeprofilinglinksgutcommunityvariationtomicrobialload.nature551,507-511.)。如上所述，通过本发明的方法获得细菌的绝对定量，不用采用高成本的流式细胞计数，也不用对特定的dna进行定量pcr，简化了过程并且降低了成本。本发明不用针对粪便样本进行流式细菌计数实验，极大节省了该方面的实验成本及时间。通过在提取后的粪便样本gdna后加入sdna2(已知序列、相对分子质量以及加入量，可得出其准确分子数)，不用针对该片段进行专门的qpcr实验进行定量，同样极大节省了该方面的实验成本及时间。另外，sdna1和sdna2片段均来自植物基因组，与细菌的参考基因组序列无同源性；此外，本发明的方法中采用的是宏基因组测序，获得的菌群数据信息相比16s测序更全面准确。本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。序列表<110>康美华大基因技术有限公司<120>一种宏基因组绝对定量的方法<130>hp190001lz<141>2019-11-13<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>5530<212>dna<213>人工序列()<400>1aataaccgaaagcctctggaactcaataccaagcctaatcaaagtcgttgagacttgcac60ttgcagatcaccgtgcttgcttatcgtgacattaagaacatcaccaacatgtctcatatg120atcaacaaagttctgtaactgattcgagtcttgaacttgaacaagagtcggaggaaggtc180ttgagccgagtcaagagcagtctgcagctcgataacttgagaccgagataacggtttcgt240aatcggaacatcttgaataactgcagacttgtatcctttcgtttcaaacgtgaggaaagg300catcggttgtgtacagttaggagggagctttttgacaagcttgatctgcagtctgtttga360agctaatccaccactgaactcagtacaaatactaacactgctcttcaccgctcgatacag420aagagcaacatctaaggagaaagcgatacggtcctcgttctggctcgagatacggtaatc480atcaaagagaacatctttgcgaaactgagcaatgcattgaactccatcaccattgagaag540gttatggaggaagaacaagtgttctttagtgagaagaagatgacaattcttccccatttt600gtcaaacgctggaagaaacctcttctctaagagattcacaccattttcagtcagaaacgc660cttgaacttcatttcactgttacaaagaaacaagacgatgagtgaatctttagtagaaat720cactctacgaactcaaattttggcacagatttcggagaaaaagcgattcttcaaaactaa780aagaccagattcaatcaaacacaagactattcaaatttaggttaaattcgaatgcaatca840aaacatcggattgtatgaaattgaaataattaaacgattggagaatcgtgaattgttaga900atcgtttcaagtatacagttcataaactcaccggaatcaatagtttgtaatattctgacc960ggagatcaccggaatcgtctgctggatgaaggaaactgtagctgcgttgaagaaatcaaa1020caatctatatcaaaattcatgagcacagtagagaaagatgacagattcagagaatttagg1080aattcaccaactaagaaattttctgaatttttgcgccaaaaacaactctgagattgaagg1140agagggaaactggtagatttttatttcttctgaaattttgtgtaccaagcccattaccat1200tagtgtcatatgcatacatgctcaaaagcccataggggtaaaatgggaaactggttataa1260ctttttaaagaaaaaaaacttaagtttgaagaacttttgaatgatcaaatttatttacca1320agctgcctatttgcattatttttggcttcattaatctgttattacagctctatgtcaaga1380tataaaattttacagcaaacaaaaattaaaataagctccttttctttatatacatacaga1440tatagtttcagaaattcttctataaacactagtcttgtttttcttctacactatgaactt1500tatccaaagactcttgaagaacttgcattgcgactttataatgatccaaagataccgctc1560cttcttcaactacctgaagagagtttttatacaactggtcaaaccattgaacccggtccg1620taccatcgacaaaaccagtcaagccgttatcagcgaagtggaggcgtttgtagtcttttc1680tccaccgaggtagaatataccgtaaagggatttcttcaacgccgttgaaattgagaacac1740atagagcatgtctgcataagtatccgtagaagttgaagcagctacaaatgcaacgtactt1800cgccaactgatctgttgtacagaacttcgaaatcgcggatttctcttctgctggattcgc1860ctcggacccgttctttcacaaggaagatcacgaaaggtccatcgacatggacctgcgttg1920tgctgaaacatgagtacatttcttctacctctatttggaatttcttgaacatgtctctcg1980tgtagattctcgagagctgtgtctcgaaagaacactttgttttaagctccgcggtgttca2040aggtttgagactctatgtcgctgagagtttcttccctgtgcttcttctgaagagctagct2100cgtacttatcgagaaactctttcaatggtgtttgcttgtgaacatacctctcgaaaaatg2160gtttcagggtttctccaggatgagcagcggcgattcctgcaaaaaaagtgtctttgagat2220aaaccggagcccatttagctctctcttcatacaaggaacggagccattcattctcgataa2280ccccaaaattgtgaaccatgaacccccaagctgcttcaaactcaacaacttttaaggttt2340cgtaaactgctttcgtaaatgccttcctcacggcatcataattatgcagcccccctaatt2400tctctggaattttcctcattatatgtgtcagactgaatctctgatgagatcttgggaaca2460cttga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