小疣刺参促排卵短肽及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小疣刺参促排卵短肽及其编码基因与应用。

背景技术：

小疣刺参(stichopusmonotuberculatus)俗称“黄肉参”，是我国热带海参中具有代表性的高经济价值种类，不仅可食用，亦可作为化妆品和医药的原料。

小疣刺参的人工育苗近几年获得初步成功，主要是采用阴干流水法进行催产，该方法对小疣刺参雄参的催产效果较好，但采用该方法雌参的排卵比例较低，再加上小疣刺参排精排卵存在月相规律，即仅在每年阴历5-8月初一左右的一两天可催产成功，阻碍了小疣海参的产业化人工养殖。因此，迫切需要一种高效的小疣刺参催产方法。

棘皮动物ngiwyamide(ng小肽)最初是从仿刺参的放射状神经索和神经环中分离获得的，是一种结构上类似于脊椎动物ng肽的神经肽，它可诱导仿刺参的体壁和肠道肌肉收缩，刺激海星的管足活动和紫海胆的管足和食道收缩。由于注射ng小肽后会使仿刺参头部发生摆动，因此将其前体蛋白命名为cubifrin。研究发现，注射ng小肽，可以刺激仿刺参卵母细胞的发生和成熟。然而，目前尚无小疣刺参cubifrin基因序列及其衍生小肽的相关研究。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种小疣刺参促排卵短肽及其编码基因与应用。

为实现上述发明目的，本发明以本课题组构建的小疣刺参卵巢转录组文库中cubifrin基因的转录本序列为基础，通过rt-pcr扩增获得cubifrin基因的开放读码框(orf)，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其编码cubifrin前体蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。该基因的前体蛋白包含5个ng小肽(ngiwy、ngfwy、ngiwy、ngiwy和nglwy)(图1)，翻译后可加工形成3种衍生ng小肽：ngiwy、ngfwy和nglwy，其氨基酸序列如分别如seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5所示。由于cubifrin基因的ng小肽可刺激海参卵母细胞的发生和成熟，因此，ngiwy、ngfwy和nglwy可作为刺激小疣刺参雌参排卵的短肽应用于小疣刺参人工育苗。

本发明还提供了一种重组表达载体，其含有上述的小疣刺参cubifrin基因，所述的小疣刺参cubifrin基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的重组表达载体。

本发明还提供了一种刺激小疣刺参雌参排卵的试剂，其包含有上述的衍生ng小肽中的ngiwy、ngfwy和/或nglwy。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

本发明首次披露了小疣刺参cubifrin基因序列及其编码蛋白和衍生ng小肽的相关研究，发现小疣刺参cubifrin基因的前体蛋白包含5个ng小肽(ngiwy、ngfwy、ngiwy、ngiwy和nglwy)，翻译后可加工形成3种衍生ng小肽：ngiwy、ngfwy和nglwy。与仿刺参、糙海参和玉足海参的cubifrin基因的ng小肽相比，ngfwy和nglwy为小疣刺参所特有。所述的ngiwy、ngfwy和nglwy可作为刺激小疣刺参雌参排卵的短肽应用于小疣刺参人工育苗。

附图说明

图1为小疣刺参cubifrin基因的核苷酸序列及其编码蛋白。

图2为四种海参cubifrin前体蛋白翻译后加工形成的衍生ng小肽序列比对。

图3为小疣刺参cubifrin前体蛋白3个衍生ng小肽对对小疣刺参排卵的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1：小疣刺参cubifrin基因的cdna克隆及测序

1、小疣刺参卵巢总rna的提取及第一链cdna的合成

以小疣刺参卵巢组织为材料，采用trizol法(invitrogen)提取总rna。以总rna为模板，使用primescript^tmrtkit(takara)进行反转录pcr，获得第一链cdna。

2、小疣刺参cubifrin基因的cdna克隆及ng小肽分析

2.1小疣刺参cubifrin基因的cdna克隆

2.1.1引物设计

以已构建的小疣刺参卵巢转录组文库中的cubifrin转录本序列为基础，设计上游引物(5’-atggcggtagaagcaaag-3’)和下游引物(5’-ttacatcacctcgtctgt-3’)。

2.1.2pcr扩增

以第一链cdna为模板，使用上述上游引物和下游引物进行pcr扩增。pcr反应体系为：rtaqmixture(takara)12.5μl，cdna模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，灭菌水9.5μl，共25μl；pcr反应程序为：94℃3分钟预变性；30个循环：94℃15秒变性，56℃15秒复性，72℃1分钟延伸；72℃3分钟最后延伸。

2.1.3cubifrincdna扩增片段的克隆及测序

将2.1.2pcr扩增获得的产物(cubifrincdna扩增片段)在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物)对琼脂糖凝胶电泳中的目的条带进行回收，使用pmd18-tligationkit(takara)对cubifrincdna扩增片段进行ta克隆。使用热休克法用上述连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，扩大培养并提取质粒进行测序。

结果显示，小疣刺参的cubifrin基因的开放读码框(orf)为723bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示；编码240个氨基酸(图1)，氨基酸序列如seqidno.2所示。

2.2小疣刺参cubifrin基因的ng小肽分析

对小疣刺参cubifrin基因的氨基酸序列进行分析，结果显示，小疣刺参cubifrin基因的前体蛋白包含5个ng小肽(ngiwy、ngfwy、ngiwy、ngiwy和nglwy)(图1)，通过neuropredsoftware(http://stagbeetle.animal.uiuc.edu/cgi-bin/neuropred.py)预测，cubifrin基因翻译后可加工形成3种衍生ng小肽：ngiwy、ngfwy和nglwy，其氨基酸序列分别如seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5所示。与仿刺参、糙海参和玉足海参的cubifrin基因的ng小肽相比，ngfwy和nglwy为小疣刺参所特有(图2)。

3.小疣刺参cubifrin3个衍生ng小肽对小疣刺参雌参排卵作用的影响实验

小疣刺参cubifrin3个衍生ng小肽ngiwy、ngfwy和nglwy由上海生工公司合成，并溶解于0.9％生理盐水。将150头小疣刺参随机分为5组(30头海参/组)，即对照组、阴干流水法处理组、ngiwy注射组、ngfwy注射组和nglwy注射组，其中3个ng小肽组的注射量均为6.5ng/g体重，而对照组和阴干流水法处理组均注射0.9％生理盐水。采用1ml常规注射器，将100μl生理盐水或ng小肽穿过体表，注射到海参体腔中。注射后将海参放置于1m³海水缸，观察48小时，统计排卵个体数量。如图3所示，不催产、阴干流水法、ngiwy注射、ngfwy注射和nglwy注射组小疣海参排卵比例分别为0％、3.3％、13.3％、26.7％和10％(图3)。结果表明，注射ngiwy、ngfwy、nglwy均能刺激小疣刺参排卵，可作为刺激小疣刺参雌参排卵的短肽应用于小疣刺参人工育苗。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国科学院南海海洋研究所

<120>小疣刺参促排卵短肽及其编码基因与应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>723

<212>dna

<213>小疣刺参(stichopusmonotuberculatus)

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