一种人工密码子优化的猪瘟病毒E2蛋白及其制备方法与用途

一种人工密码子优化的猪瘟病毒e2蛋白及其制备方法与用途
技术领域
1.本发明属生物技术领域，涉及一种人工密码子优化的猪瘟病毒e2蛋白及其制备方法与用途。本发明通过优化与合成可猪瘟病毒e2蛋白编码基因，利用人工合成核苷酸序列构建表达载体。获得的优化猪瘟病毒e2蛋白可用于制备猪瘟亚单位疫苗及制备猪瘟诊断试剂盒。


背景技术：

2.据资料记载，猪瘟(classical swine fever，csf)又称猪霍乱(hog cholera)，是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，csfv)引起的一种急性、高热、接触性传染病，是严重威胁猪健康的重要传染病之一。据记载，猪瘟最早流行在19世纪的美国，随后迅速在世界范围内传播，给世界养猪业造成了严重的经济损失。1984年猪瘟被世界卫生组织(oie)列为a类传染病，在中国也被列为一类传染病。面对严重危害养猪业的猪瘟疫情，世界各国纷纷不断完善有效的诊断方法和防控技术，猪瘟得以控制。在欧洲的一些国家，经过严格的控制与预防，猪瘟疫情已经达到完全消灭的态势。但是近些年来，猪瘟由早期的急性感染转变为慢性或非典型的症状呈现，这给猪瘟的防治带来极大的挑战。为应对猪瘟疫情越来越严峻的考验，针对猪瘟疫苗的研发及血清抗体诊断方法的建立已引起本领域研究人员的关注，这对世界范围内猪瘟疾病的诊断与防控具有重要意义。
3.csfv属于病毒界黄病毒科(flaviviridae)瘟病毒属(pestivims)，是单股正链rna病毒，其基因组编码4个结构蛋白和8个非结构蛋白，其中，4个结构蛋白分别为c、e0、e1和e2，其中c蛋白为衣壳蛋白，其余为囊膜糖蛋白；研究显示，所述囊膜蛋白e0、e1和e2在病毒的脱衣壳与入核阶段起到重要作用，c蛋白在维持病毒核酸稳定起到关键作用。
4.研究显示，结构蛋白在诱导宿主产生保护性免疫中也起到重要作用，c蛋白可以激活宿主的细胞介导的免疫反应，蛋白不能诱导机体产生中和性抗体，e0蛋白与病毒的毒力相关，其抗体可以阻断病毒对细胞的感染，e2蛋白是csfv主要保护性抗原蛋白，能激活宿主产生保护性免疫，诱导产生抗csfv中和抗体，因此，e2蛋白一直作为研制csfv新型疫苗和血清抗体检测的首选靶蛋白。
5.研究公开了e2蛋白上分布着5个n-糖基化位点，这些糖基化位点在激活宿主保护性免疫中起到重要的作用；。此外，e2能够形成同源二聚体或者与e1形成异源二聚体，其空间结构包含3个疏水区和3个n端链内二硫键；因此，e2蛋白正确糖基化不仅对于e2蛋白结构的稳定起到关键作用，也对激活宿主免疫功能起到重要作用。目前，重组e2蛋白的制备多采用原核表达系统，虽然原核表达系统操作简单，产量高，但由于细菌不能进行糖基化修饰，原核表达系统制备的重组的e2蛋白不能激活宿主的保护性免疫。有研究利用杆状病毒在昆虫细胞表达系统中可以制备重组e2蛋白，昆虫表达系统虽然可以进行蛋白的糖基化修饰，但由于猪病病毒是感染哺乳细胞，e2的糖基化修饰与昆虫细胞的糖基化修饰具有一定的差别，会导致e2蛋白结构和功能与天然蛋白具有一定的差异。有报道关于哺乳细胞表达系统用于猪瘟e2蛋白制备，但由于产量低，制备成本高，难以用于实际生产。
6.基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供制备高产量的糖基化猪瘟病毒e2蛋白，不仅可以用于猪瘟的诊断，也可用于猪瘟亚单位疫苗的开发；具体涉及一种人工密码子优化的猪瘟病毒e2蛋白制备方法与用途


技术实现要素：

7.本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供制备高产量的糖基化猪瘟病毒e2蛋白及其方法，具体涉及一种人工密码子优化的猪瘟病毒e2蛋白制备方法与用途，制备的猪瘟病毒e2蛋白不仅可以用于猪瘟的诊断，也可用于猪瘟亚单位疫苗的开发。
8.本发明提供了一种优化的猪瘟病毒e2蛋白及其编码基因，产生本发明的基因序列的方法不受特别的限制。
9.本发明中，编码所述的优化的猪瘟病毒e2蛋白编码核苷酸序列为seq1，其氨基酸序列为seq2。
10.含有编码本发明的优化的猪瘟病毒e2蛋白及其编码基因的质粒载体构成本发明的一个部分。
11.本发明提供了一种质粒载体，含有编码所述的优化的猪瘟病毒e2蛋白的dna，它能插入编码本发明的优化的猪瘟病毒e2蛋白的编码基因；本发明的质粒不受特别限制，优选pcdna3.4。
12.表达本发明的含有优化的猪瘟病毒e2蛋白编码基因的宿主细胞构成本发明的一个部分。
13.本发明提供了一种中华仓鼠卵巢细胞cho为宿主细胞，它能高效稳定表达本发明优化的猪瘟病毒e2蛋白。本发明的宿主细胞不受特别的限制。
14.在本发明的实施中，筛选能表达优化的猪瘟病毒e2蛋白的质粒载体的方法不受特别的限制，可通过例如免疫印迹、elisa等进行选择。
15.本发明的实施中，纯化优化的猪瘟病毒e2蛋白的方法不受特别的限制，但首选是通过表达蛋白上携带的6
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his tag经ni-nta柱纯化。
16.本发明所制备优化的猪瘟病毒e2蛋白鉴定的方法不受特别限制，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、western blotting等。
17.本发明的另一个目的在于提供含有如前所述优化的猪瘟病毒e2蛋白活性成分的血清学检测方法。
18.本发明获得的优化猪瘟病毒e2蛋白可用于制备猪瘟亚单位疫苗及制备猪瘟诊断试剂盒。
19.所述的优化的猪瘟病毒e2蛋白可用于制备检测伪狂犬病的血清学检测试剂盒。
20.本发明的优化的猪瘟病毒e2蛋白能够在哺乳动物细胞表达系统中高效表达，并可猪瘟毒株感染的猪的血清所特异性识别，猪瘟诊断具有应用价值。
附图说明
21.图1猪瘟病毒疫苗株e2蛋白基因gc分析图。
22.图2猪瘟病毒疫苗株e2蛋白密码子分析图。
23.图3猪瘟病毒疫苗株e2蛋白gc分析图。
24.图4猪瘟病毒疫苗株e2蛋白密码子分析图。
25.图5重组猪瘟病毒疫苗株e2蛋白电泳。
26.图6重组猪瘟病毒疫苗株e2蛋白与猪血清反应结果。
具体实施方式
27.实施例1猪瘟病毒疫苗株e2蛋白基因分析及编码的优化与改造
28.对猪瘟病毒疫苗株e2蛋白基因进行gc含量及分布进行分析，评估e2蛋白基因中密码子在哺乳动物细胞表达系统中的翻译效率，结果显示e2蛋白基因中gc在整个序列中平均分布在50％(如图1所示)，其中仅有50％的密码子可在哺乳动物细胞表达系统高效翻译，部分序列中cg含量低于40％(如图2所示)，说明猪瘟病毒疫苗株e2蛋白基因在哺乳动物细胞中表达效率不高；本发明根据哺乳动物细胞对密码子的选择性，将猪瘟病毒疫苗株e2蛋白基因上不适合的翻译的密码子进行逐一优化，经过优化后，gc在整个序列中平均含量优化到60％(如图3所示)，95％的密码子在哺乳动物细胞表达系统中翻译效率在85％以上(如图4所示)；本发明中，为提高猪瘟病毒疫苗株e2蛋白结构稳定性及外泌性，将n末端的添加il-1信号肽，并将333位的甲硫氨酸残基突变为精氨酸残基，最后形成一个优化的猪瘟病毒e2蛋白基因seq1，氨基酸序列为seq2。
29.实施例2重组优化的猪瘟病毒e2蛋白表达质粒pcdna3.4-csfv-e2的构建
30.将人工合成的优化的猪瘟病毒e2蛋白基因利用in-fusion试剂盒连入pcdna3.4载体中。转入大肠杆菌jm109，将菌液涂布于lb琼脂板(含氨苄青100μg/ml，氯霉素34μg/ml)，37℃过夜培养后，挑取克隆，抽提重组质粒进行酶切鉴定，结果显示成功构建了优化的猪瘟病毒e2蛋白的重组质粒pcdna3.4-csfv-e2，由上海英俊生物有限公司对该重组质粒进行测序鉴定，并采用vector nti 10软件，推定氨基酸序列，其结果于原始设计的优化的猪瘟病毒e2蛋白基因一致。
31.实施例3，重组优化猪瘟病毒e2蛋白的表达及纯化
32.重组质粒pcdna3.4-csfv-e2通过3000脂质体转入中华仓鼠卵巢细胞cho-k1中，通过g418两周筛选后，进行单克隆培养，收集克隆培养上清，利用fortebio octet k2系统通过anti-his(his2)biosensors检测培养上清中e2蛋白表达产量，筛选出高效稳定表达优化猪瘟病毒e2蛋白的细胞株。通过无血清驯化后，进行扩大化培养，收集培养上清，通过选用his结合树脂(novagen,madison,wis.)进行提纯。每升培养中可获纯化的优化猪瘟病毒e2蛋白50mg。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测其纯度。经12.5％的sds-page检测，在分子量大约50kd处出现目的蛋白表达条带(如图5所示)。
33.实施例4重组蛋白敏感性与特异性检测
34.96孔酶标板每孔加入含0.5μg重组的优化猪瘟病毒e2蛋白的coating buffer 100μl，4℃湿盒中过夜。pbs(含0.05％tween20)洗板后每孔加入含3％脱脂奶的pbs 400μl，湿盒中室温封闭1h，每孔中分别加入100μl猪瘟疫苗免疫猪或猪瘟病毒野毒株感染猪的血清(1:50稀释)，湿盒中室温孵育1h。pbs(含0.05％tween20)洗板后每孔中加入100μl辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪igg(1:1000稀释)100μl，湿盒中室温孵育1h。pbs(含0.05％tween20)洗板后加入显色液200μl/孔，室温下避光反应30min，最后每孔加入2m h2so4 50μl终止显色反应。酶标仪490nm测定吸光度；
35.elisa检测结果显示，重组的优化后的猪瘟病毒e2蛋白不仅可与经过猪瘟疫苗免疫的猪血清中抗体特异性结合，也可以与猪瘟野毒株感染猪血清中抗体特异性结合，结果说明优化的猪瘟病毒e2蛋白可以特异性的被抗猪瘟病毒抗体识别；以优化的猪瘟病毒e2蛋白对132份临床标本进行检测，与商业化阻断抗体检测方法比较，其准确率为92％，特异性为92.5％，敏感性为93.83％。
36.实施例5重组蛋白免疫活性检测
37.2只6周健康雄性balb/c小鼠，将150ug纯化后的猪瘟病毒e2蛋白与等体积的完全福氏佐剂混匀后，100ul/只腹腔注射；1周后以150ug纯化后的猪瘟病毒e2蛋白与等体积的不完全福氏佐剂混匀后，100ul/只腹腔注射；经过3次免疫后，小鼠剪尾采血，经检测免疫小鼠的血清效价高于1:240000，结果说明优化的猪瘟病毒e2蛋白可以诱导动物产生高滴度抗体。
38.39.40.41.42.43.44.45.46.