1.赤眼鳟ips-1基因多克隆抗体的制备方法,其特征在于,步骤如下:
(1)赤眼鳟ips-1基因的克隆
提取赤眼鳟脾脏组织总rna,反转录合成5’和3’cdna第一链,设计两对特异性引物:ips-1-5’(w)和ips-1-3’(w),ips1-1-5’(n)和ips1-1-3’(n),核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示;使用ips-1-5’(w)和ips-1-3’(w)进行第一轮5’race-pcr和3’race-pcr扩增,获得产物作为第二轮pcr的模板;利用第二对特异性引物ips1-1-5’(n)和ips1-1-3’(n)进行第二轮5’race-pcr和3’race-pcr扩增,对pcr产物进行纯化、连接t载体,转化并测序;拼接获得赤眼鳟ips-1基因全长cdna序列;
(2)赤眼鳟ips-1基因重组表达载体的构建
设计第三对特异性引物ips-1-of和ips-1-or,核苷酸序列分别如seqidno.5和seqidno.6所示;分别在上、下游引物添加了bamhi和xhoi酶切位点;以步骤(1)得到的赤眼鳟脾脏组织cdna为模板,ips-1-of和ips-1-or为引物,进行pcr扩增;将pcr产物和pet-28a(+)表达载体进行双酶切,回收纯化,t4连接酶连接,转化大肠杆菌dh5α,获得重组表达载体pet-28a-sumo-ips-1;
(3)赤眼鳟ips-1蛋白表达及破菌流程
将步骤(2)得到的重组表达载体pet-28a-sumo-ips-1转化大肠杆菌bl21(de3),在含有50mg/l卡那霉素的lb培养液中培养至od值为0.6时,加入iptg进行诱导;离心收集菌体;破菌后sds-page电泳确定蛋白表达位置及纯度;
(4)重组蛋白的纯化及浓度测定
利用纯化试剂盒对重组蛋白上样、洗脱、样品处理及再生等处理方法进行纯化;采用lowry法侧蛋白浓度;设置不同浓度的标准蛋白质溶液,绘制标准曲线,根据样品的光吸收值与标准曲线计算样品蛋白浓度;
(5)多克隆抗体的制备
将步骤(4)纯化的赤眼鳟pet-28a-sumo-ips-1重组蛋白作为抗原,对新西兰大白兔进行免疫,然后进行全血分离,收集兔抗血清,纯化得到赤眼鳟ips1多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,第一轮5’race-pcr和3’race-pcr扩增反应程序为94℃5min;5个循环的94℃30s,72℃3min;5个循环的94℃30s,70℃30s,72℃3min;30个循环的94℃30s,68℃30s,72℃3min。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,第二轮5’race-pcr和3’race-pcr扩增反应条件为94℃5min;30个循环的94℃30s,68℃30s,72℃3min,然后72℃7min。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,破菌方法为:取50ml的1×pbs悬浮菌液,加入50μl巯基乙醇;利用超声破破碎仪,设置破菌时间3s,间隔3s,共10min超声破菌;离心10min得到1号上清液和沉淀,将1号上清液装于50ml离心管中,暂放4℃保存;沉淀先用去离子水洗涤两遍,然后称取6g尿素用1×pbs溶解定容到44ml中,倒入沉淀,吹悬沉淀;继续按破菌3s,间隔3s的设置,破菌5min;破菌后,12000r/min离心10min得到2号上清液和包涵体,吸出2号上清液暂放4℃保存待用;向包涵体中加入6mlddh2o悬浮后平均装到4个离心管中,12000r/min离心2min;弃上清,选取其中一管加入1.5ml8m的尿素,溶解,12000r/min离心1min,将上清转移到新的离心管中。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(5)中,对新西兰大白兔进行免疫的方法为:将纯化的赤眼鳟pet-28a-sumo-ips-1重组蛋白作为抗原,对新西兰大白兔进行8次免疫,按体积比1:1的比例加入弗氏完全佐剂,采用背部皮下多点注射;加强免疫选用弗氏不完全佐剂;末次免疫10天。
6.用于赤眼鳟ips-1基因全长cdna序列克隆的引物对,其特征在于,引物对有两组,分别为ips-1-5’(w)和ips-1-3’(w),ips1-1-5’(n)和ips1-1-3’(n),ips-1-5’(w)和ips-1-3’(w)核苷酸序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示;ips1-1-5’(n)和ips1-1-3’(n)核苷酸序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示。
7.用于赤眼鳟ips-1基因克隆的引物对,其特在于,引物对为ips-1-of和ips-1-or,核苷酸序列分别如seqidno.5和seqidno.6所示。
8.权利要求6或7所述的引物对在赤眼鳟ips-1基因克隆上的应用。