一株高产果胶酶的黑曲霉菌株及其应用的制作方法

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高产果胶酶的黑曲霉菌株及其应用。

背景技术：
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果胶酶是一类能够通过水解和裂解作用降解果胶质的酶的总称，是含有多种组分的复合酶，主要包括原果胶酶、果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶4大类。果胶酶初见于1930年，用来制备酒水和果汁。在20世纪60年代，科学家对植物组织成分的化学性质已经有了比较清楚的认识，因此人们能够更广泛、有效地利用果胶酶。

据报道，自然界中已发现有40多种微生物能产果胶酶，有曲霉属、青霉属、镰孢属、克鲁维氏酵母及某些兼性厌氧细菌等。目前国外多以黑曲霉、根霉和盾壳霉发酵法制取果胶酶，国内也以黑曲霉发酵的报道为多。目前国外对于果胶酶的研究、开发和生产技术都比较成熟，我国的研究人员在果胶酶的菌种选育、生产工艺和应用等方面做了许多工作。果胶酶的应用领域非常广泛，不仅可用于食品工业方面，还广泛应用于麻类脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处理和饲料等行业。但由于起步较晚，酶活力低，生产成本高，严重限制了该酶的广泛应用，目前主要用于果汁制造、果酒酿造、罐头加工、木材防腐、纸浆漂白、麻类脱胶以及防治植物病害等方面。

因此筛选出一株高产耐酸的黑曲霉菌株，并且获得其液体发酵的方法，对于大规模推进工业化生产、提高国内果胶酶的应用范围具有重大意义。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一株高产果胶酶的黑曲霉及其液体发酵产酶方法，在确保黑曲霉发酵高产果胶酶稳定性的同时，显著提高果胶酶的耐酸性。

本发明的目的是通过以下技术方案实现目的：

一株高产果胶酶的黑曲霉，所述菌株为黑曲霉(aspergillusniger)ld-092，菌株保藏号为cgmccno.18559。

本发明所述的黑曲霉ld-092是通过对黑曲霉原始菌株aj213进行co⁶⁰射线诱变处理得到的，所述的黑曲霉ld-092已于2019年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，菌株保藏号为cgmccno.18559。

本发明的另一目的在于提供上述黑曲霉ld-092的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：

斜面培养：挑取一环黑曲霉ld-092接种于固体斜面培养基，30℃下恒温培养36h，得一级种子；

摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温30℃，摇床转速200r/min条件下培养48h，得二级种子液；

种子罐培养：将二级种子液按照接种量15％(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温30℃，转速200r/min条件下培养45h；

发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量6-8％(v/v)的比例接入发酵培养基，恒温30-31℃，转速200-250r/min，设置通风量：1-2vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液ph值为4.5，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为150h-155h，得到最终发酵液；发酵液中的果胶酶酶活为80000-85000u/ml。

将最终发酵液通过提取与精制方法，获得果胶酶成品液体酶制剂。

所述斜面培养基(g/l)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂17，ph4.5，121℃灭菌20min；

所述种子培养基(g/l)：葡萄糖20，细麸皮20，玉米浆4.5，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁1，ph4.5，121℃灭菌20min；

所述种子罐培养基(g/l)：葡萄糖80，细麸皮30，酵母膏4.55，玉米浆4.4，硫酸铵1.5，硫酸镁0.8，磷酸二氢钾1.5，氯化钙1，ph4.5，121-123℃灭菌30min；

所述发酵培养基(g/l)：玉米淀粉300，豆饼粉30，细麸皮50，玉米浆27，硫酸镁1.2，硫酸铵4，磷酸二氢钠2.5，氯化钙0.8，ph4.5，121℃灭菌30min；

所述补料培养基(g/l)：麦芽糖600，玉米浆22，硫酸镁1.5，121℃灭菌30min。

所述果胶酶的提取与精制方法如下：

先将最终发酵液加入1～5％珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；

用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；

在所述浓缩液中加入质量百分比15％(m/v)稳定剂、0.45％(m/v)防腐剂，调节ph4.5，然后进行过滤除菌，即得到果胶酶成品液体酶制剂。

优选地地，所述稳定剂为甘油，所述防腐剂为质量比为1:2的山梨酸钾和苯甲酸钠。

所述黑曲霉ld-092发酵所产的果胶酶最适作用ph范围为2.5-4.0；最适作用温度范围为30-50℃；在ph为3.0-4.0下保存36h，酶活保持在85％以上。

有益效果：

本发明通过对黑曲霉原始菌株aj213进行co⁶⁰射线诱变处理诱变选育了一株高产果胶酶的突变菌株ld-092，并对黑曲霉ld-092发酵过程进行补料条件优化使其酶活达到80000

u/ml至85000u/ml之间，而黑曲霉原始菌株aj213通过液态发酵后最高酶活为69200u/ml。由此可以看出，黑曲霉ld-092显著高于黑曲霉原始菌株aj213的酶活。

本发明菌株的发酵方法中培养基成分均来源于成本较低的原料，且在提高发酵产能、提升生产效率的同时，大大减少发酵成本，对生产具有极大帮助。

黑曲霉ld-092发酵得到的果胶酶最适ph范围为2.5-4.0，最适作用温度范围为30-50℃，具有显著的耐酸性，在ph为3.0-4.0下保存36h，酶活保持在85％以上，可广泛应用于工业生产中，显著地拓展了果胶酶的工业应用范围，提高了果胶酶的应用价值。

附图说明：

图1：不同ph下的相对酶活；

图2：不同温度下的相对酶活；

图3：耐酸性曲线。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1黑曲霉ld-092发酵产酶及其所产果胶酶的提取方法

黑曲霉ld-092的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：

斜面培养：挑取一环黑曲霉ld-092接种于固体斜面培养基，30℃下恒温培养36h，得一级种子；

摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温30℃，摇床转速200r/min条件下培养48h，得二级种子液；

种子罐培养：将二级种子液按照接种量15％(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温30℃，转速200r/min条件下培养45h；

发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量6％(v/v)的比例接入发酵罐培养基，恒温30℃，转速200r/min，设置通风量：1-2vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液ph值为4.5，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为155h，得到最终发酵液；发酵液中果胶酶酶活83210u/ml；

将最终发酵液通过提取与精制方法，获得果胶酶成品液体酶制剂。

所述斜面培养基(g/l)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂17，ph4.5，121℃灭菌20min；

所述种子培养基(g/l)：葡萄糖20，细麸皮20，玉米浆4.5，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁1，ph4.5，121℃灭菌20min；

所述种子罐培养基(g/l)：葡萄糖80，细麸皮30，酵母膏4.55，玉米浆4.4，硫酸铵1.5，硫酸镁0.8，磷酸二氢钾1.5，氯化钙1，ph4.5，121-123℃灭菌30min；

所述发酵罐培养基(g/l)：玉米淀粉300，豆饼粉30，细麸皮50，玉米浆27，硫酸镁1.2，硫酸铵4，磷酸二氢钠2.5，氯化钙0.8，ph4.5，121℃灭菌30min；

所述补料培养基(g/l)：麦芽糖600，玉米浆22，硫酸镁1.5，121℃灭菌30min。

果胶酶的提取与精制方法如下：

先将最终发酵液加入1～5％珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；

用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；

在浓缩液中加入质量百分比15％(m/v)甘油、0.15％(m/v)山梨酸钾、0.3％(m/v)苯甲酸钠，调节ph4.5，然后进行过滤除菌，即得到果胶酶成品液体酶制剂。

实施例2黑曲霉ld-092发酵性能验证

按照实施例1黑曲霉ld-092的发酵产酶方法进行50l发酵罐验证实验，发酵周期155h，其7批次的发酵产酶情况，发酵液中果胶酶平均酶活为82882u/ml，表1说明菌株不仅高产果胶酶而且其发酵性能以及其所产的果胶酶的酶活均具有显著的稳定性。

表17批次高产果胶酶菌株的发酵产酶情况

实施例3果胶酶酶活测定方法

(1)酶液的制备：发酵液6000r/min离心15min，收集上清液即为粗酶液。

(2)测定方法：采用3、5-二硝基水杨酸法(dns法)。取0.5ml适当稀释的粗酶液于25ml比色管中，加入2.0ml0.4％果胶溶液(ph4.0)作为底物溶液，45℃水浴反应30min，加入dns溶液煮沸5min，冷却，定容至25ml，520nm测定吸光值。

(3)酶活定义：在一定条件下，每分钟分解果胶生成1μmol半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位(u)。

实施例4果胶酶的最适作用ph范围

以本发明所产，在温度40℃、ph3.5的条件下测定的酶活力80000u/ml的果胶酶为相对酶活力100％，分别用相应的ph缓冲液，其他条件不变，测定酶活力。将酶液分别置于ph为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的缓冲液中，测定的相对酶活力变化曲线如图1所示，果胶酶在ph3.5时的酶活力最高，作用ph较宽在2.5-4.0。

实施例5果胶酶的最适作用温度范围

以本发明所产，在温度40℃、ph3.5的条件下测定的酶活力80000u/ml的果胶酶为相对酶活力100％，在ph值为3.5条件下，分别在不同温度(20、25、30、35、40、45、50、55、60、65)下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图2所示，酶的最适作用温度范围为30-50℃。

实施例6果胶酶的耐酸性测定

以本发明所产，在温度40℃、ph3.5的条件下测定的酶活力80000u/ml的果胶酶为相对酶活力100％，将酶液分别置于ph为3.0、3.5、4.0的缓冲液中，40℃静置，分别在静置6h、12h、18h、24h、30h、36h测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图3所示，其各ph条件下的相对酶活力仍然在85％以上，说明果胶酶具有较好的耐酸性。