一种水稻ACCase突变型蛋白及相应基因

本发明涉及基因领域，具体涉及一种水稻抗乙酰辅酶a羧化酶类除草剂的accase突变型蛋白。

背景技术：

粮食短缺是本世纪最严重的全球性问题之一，近年来随着社会经济的快速发展和农业技术的不断提高，粮食短缺的问题得到缓解，但为了满足由于人口迅速增长而不断扩大的粮食需求，急需提高水稻产量和改善稻米品质。随着水稻直播栽培技术在农业生产中的大面积应用，水稻直播生产中农田杂草问题成为影响农作物产量的重要因素。为了防除稻田杂草，不仅投入大量的人力物力和财力，还喷洒了大量除草剂。

由于化学除草剂的广泛使用，杂草抗性发生的速度如此之快、范围如此之广，不但增加了除草成本，也增加了环境压力。

对除草剂的施用效果，人们追求的目标是既高效地除草又确保作物安然无恙。尽管由于作物与杂草的一些生理生态的差异以及某些栽培方式的辅助，除草剂致毒时对作物和杂草有所选择，比如时差选择、位差选择及生理选择等，但作物的生长发育仍然或多或少地要受到一些影响。因此，如果作物本身具备了抗除草剂的特性，就如水稻对敌稗、玉米和高粱对阿特拉津具有不同的生化选择性而最终表现出抗性一样，除草剂的使用自然会更加方便有效。但遗憾的是自然界中能够抗除草剂的作物类型很少，能同时抗多种除草剂的作物就更是少见，对某种高效除草剂的抗性也往往仅限于少数几种作物。因此，如何运用基因工程技术解决上述问题，创造出更多抗除草剂的作物新品种，已成为当前植物基因工程研究的主要目标之一。

而传统的育种方式周期长，可利用的种质资源匮乏。因此，培育更多抗除草剂的水稻十分必要。

技术实现要素：

技术问题：本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻accase突变型蛋白。本发明利用crispr介导的a:t突变成g:c定点替换的腺嘌呤碱基编辑器(adeninebaseeditor,abe)的单碱基编辑途径产生内源抗除草剂水稻的位点，该基因所编码的蛋白的氨基酸序列对应于野生型水稻accase的氨基酸序列的第1792位发生突变。发明人发现，通过在该基因序列的1792位点进行突变，可以赋予植物抗(耐)乙酰辅酶a羧化酶类除草剂抗性。

为此，本发明提供了一种编码水稻accase突变型蛋白的核酸或基因。

在一种实施方式中，本发明提供了一种水稻accase突变型蛋白，所述accase突变型蛋白的氨基酸序列经过定点替换：其由水稻accase的氨基酸序列的第1792位发生突变。

优选地，本发明的水稻accase的氨基酸序列第1792位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。

优选地，本发明的水稻accase的氨基酸序列第1792位氨基酸突变除了缬氨酸之外的其它氨基酸。

优选地，本发明的accase突变型蛋白发生突变的氨基酸位点突变成其他氨基酸的情况也在本发明的保护范围之内，例如：第1792位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸、甘氨酸、精氨酸、丝氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸；

本发明还提供一种水稻accase突变型蛋白，包括：(a)其氨基酸序列seqidno:1，及在(a)中的氨基酸序列经过定点替换具有乙酰辅酶a羧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供一种核酸或基因，其编码所述的蛋白。

本发明所述的核酸或基因，包括：

(i)编码所述的蛋白的核酸或基因；或

(ii)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰辅酶a羧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或

(iii)其核苷酸序列选自序列表中seqidno:2所示序列。

进一步地，本发明的水稻accase突变型基因，所述水稻accase基因存在以下一种突变：只在水稻accase基因的第5374位核苷酸发生突变。

优选地，本发明的水稻accase突变型基因，所述水稻accase基因存在以下一种突变：只在水稻accase基因的第5374位核苷酸由a突变为g。

本发明的accase突变型基因发生突变的核苷酸，在上述位点突变成其他核苷酸的情况也在本发明的保护范围之内，例如：a突变为t、c、g。

本发明还提供一种表达盒、重组载体，其含有所述的核酸或基因。

本发明还提供所述的水稻accase突变型蛋白、核酸或基因，表达盒、重组载体在植物抗除草剂方面的应用。

本发明还提供获得具有除草剂抗性的植物的方法，包括如下步骤：

1)使植物包含所述核酸或基因；或

2)使植物表达所述水稻accase突变型蛋白。

进一步地，所述获得具有除草剂抗性的植物的方法为利用crispr介导的abe单碱基编辑途径。

本发明还提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法。进一步地，本发明提供了用于增强植物、植物组织、植物细胞对于至少一种除草剂的耐受性的方法，所述除草剂干扰accase酶的活性。因此，本发明中除草剂抗性指的是抗(耐)乙酰辅酶a羧化酶类除草剂。

本发明所述的增强植物、植物组织或者植物细胞对除草剂的抗性方法可以通过转化或者杂交、自交和无性繁殖的方法实施，也可通过基因定点突变的方式获得，使改变的植株包括本发明的核苷酸序列seqidno:2。

本发明所述的增强植物、植物组织或者植物细胞对除草剂的抗性方法可以通过转化或者杂交、自交和无性繁殖的方法实施，也可通过基因定点突变的方式获得，使改变的植株表达本发明的氨基酸序列seqidno:1。

本发明还提供了获取耐受除草剂的水稻植株的方法，该方法包括将含有抗除草剂突变位点的accase基因转入水稻中，该基因序列不同于野生型水稻植物的accase基因序列，是accase基因含有抗除草剂突变位点的序列。发现携带有accase突变位点的转基因水稻可以抗乙酰辅酶a羧化酶类除草剂，而野生型水稻对乙酰辅酶a羧化酶类除草剂表现敏感。本发明还提供了所述核酸或基因及蛋白在植物育种中的应用，用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，还提供了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因如水稻等植物中的应用。

附图说明

图1示出在含有潮霉素和9μmol的甲禾灵双重抗性的筛选培养基上的抗性愈伤；

图2示出在含有潮霉素和9μmol的甲禾灵双重抗性的分化培养基上的抗性愈伤长出幼苗；

图3示出在含有潮霉素和9μmol的甲禾灵双重抗性的生根培养基上，非转基因水稻(左)、及含有accase突变位点的转基因水稻(右)的生长情况；

图4示出了非转基因水稻(左)和突变型accase基因水稻在喷施80mg/ml的甲禾灵除草剂5天后的生长状况；

图5示出了突变型accase基因水稻的accase突变位点的测图；

具体实施方式

以下参照实施例对本发明进行说明。但本领域技术人员可以理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

(1)水稻accase突变位点获得和植物表达载体的构建

选择水稻acc基因中的核苷酸序列gagaatatacatggaagtgctgc(下划线部分为所述5’ngg-3’结构的pam序列)，作为打靶位点。按所选择靶位点合成(华大基因公司)正向寡核苷酸链(acc-abefp)和可与之互补的反向寡核苷酸链(acc-aberp)，

具体序列为：

acc-abefp:ggcagagaatatacatggaagtgc

acc-aberp:aaacgcacttccatgtatattctc

经过退火程序，将acc-abefp和acc-aberp两链退火形成具有粘性末端的双链dna，作为构建重组载体的插入片段。

本实施例中利用crispr介导的单碱基编辑系统，采用spcas9-ng蛋白介导的abe编辑系统phun411ng-abe进行基因编辑，该系统可使靶位点的a·t变成g·c，下面将对该过程进行展开说明。

用bsai内切酶(neb公司)在37℃酶切phun411ng-abe载体2小时，65℃失活酶切体系10分钟，作为构建重组载体的骨架片段。用t4连接酶(neb公司)将重组载体骨架片段和插入片段相连，转入大肠杆菌中。通过选择具有卡那霉素抗性且不具壮观霉素抗性的菌斑，获得阳性转化子。经测序验证后，提取阳性质粒，构成用于水稻acc基因crispr/cas9打靶的重组载体质粒，命名为phun411ng-abe-acc，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，经菌落pcr筛选获得阳性克隆，获得含有phuc411ng-abe-acc的农杆菌。

(2)阳性转基因植株获得

成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述步骤中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等过程参照yongboduan(yongboduan，chenguangzhai，etal.anefficientandhigh-throughputprotocolforagrobacteriummediatedtransformationbasedonphosphomannoseisomerasepositiveselectioninjaponicarice(oryzasatival.)[j].plantcellreport，2012.doi10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。为得到含有除草剂抗性水稻愈伤组织和幼苗，在筛选阶段，使用含有潮霉素和9μmol的甲禾灵双重抗性的培养基，待抗性愈伤组织长出后(图1)，再转入含有潮霉素和9μmol的甲禾灵抗除草剂双重抗性的分化培养基中，使其分化成苗(图2)。经过大量的筛选和分化，最终得到2株含有潮霉素和甲禾灵抗除草剂抗性的水稻植株(图3)。将获得的抗除草剂水稻移栽到土里，待其长到3-4叶幼苗期，喷施80mg/ml的甲禾灵除草剂后，植株仍然正常生长发育，而野生型水稻在喷施80mg/ml的甲禾灵除草剂5天后表现为整株死亡(图4)。

(3)水稻抗乙酰辅酶a羧化酶类除草剂突变体1792突变位点分析从获得的2株抗除草剂水稻突变植株选取叶片并提取基因组dna，使用一对引物对靶标序列上下游序列进行扩增，fp：ttccgtgttgggtggtctgatg，rp：aactgcatgtgggagctgtaca。扩增产物送invitrogen公司进行基因组测序。测序结果与野生型日本晴accase基因比较，发现在在这2株抗除草剂水稻突变植株中的accase基因上发生了1个位点的突变，第5374位点碱基发生突变，由a变成g(图5)，导致其相应编码的氨基酸序列的第1792位点由异亮氨酸变为缬氨酸，即抗除草剂突变体的accase基因的核苷酸序列如seqidno:2所示，其编码的accase蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。

从上面的实验可以证实：利用spcas9-ng蛋白介导的abe编辑系统可以对accase基因进行基因编辑，使其基因上1792位碱基发生替换，从而改变了accase的蛋白序列，赋予了含有accase突变蛋白的植株具有除草剂抗性。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

序列表

<110>安徽省农业科学院水稻研究所

<120>一种水稻accase突变型蛋白及相应基因

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>3

<211>2327

<212>prt

<213>突变蛋白(manmade)

<400>3

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