一种与大黄鱼抗鳗弧菌关联的SNP位点、其筛选方法和应用与流程

本发明属于鱼类分子标记筛选技术领域，涉及一种与大黄鱼抗鳗弧菌关联的单核苷酸多态性(snp)分子标记，特别涉及一种位于大黄鱼il-6r基因上与抗鳗弧菌关联的snp位点、其筛选方法和应用。

背景技术：

大黄鱼(larimichthyscrocea)俗称黄鱼、黄姑鱼、黄花鱼，鲈形目、石首鱼科、黄鱼属。大黄鱼体形长，侧扁；头大且尖锐；尾柄细而长；鳞片小，身体侧的鳞片通常有金黄色的腺体；侧线完全，前部略微弯曲，直鱼身背部背面和上部呈黄棕色，下部和腹面呈金黄色。大黄鱼是浅海近底层鱼类，不喜强光，肉食性。它们是浙江、福建、广东等地区网箱养殖的主要经济鱼类。

鳗弧菌(vibroanguillarum)可以感染大黄鱼等海洋经济鱼类患病。被鳗弧菌感染的大黄鱼等海产品，会出现体表发黑，肌肉组织红肿充血，鳍部溃烂，鳍条、鳍的基部和肱骨下部充血发红，肛门红肿等症状，解剖感染的病鱼发现肠道发黑肠粘膜脱落，腹腔内出水，肾脏出血、肝脏坏死等症状。

传统的遗传育种要选育多代，速度慢、成功率低。从遗传角度出发，snp分子标记不仅可以评估大黄鱼遗传多样性，还为大黄鱼的抗鳗弧菌选育工作提供直接的遗传标记，目前还没有与大黄鱼抗鳗弧菌相关的snp位点的相关报道。

技术实现要素：

本发明针对鳗弧菌感染大黄鱼患弧菌病，提供一种位于大黄鱼il-6r基因上与抗鳗弧菌关联的snp位点，确定大黄鱼免疫相关基因的snp位点与抗鳗弧菌关联，为大黄鱼抗鳗弧菌的选育提供分子标记。

本发明中，与大黄鱼抗鳗弧菌相关的snp位点，位于大黄鱼如seqidno:1所示的il-6r基因cdna序列上，其1021位碱基处存在一个g或c的等位基因突变，且该突变引起第341位氨基酸由缬氨酸val(gug)突变为亮氨酸leu(cug)。

本发明还提供了上述与大黄鱼抗鳗弧菌相关的snp位点的筛选方法，包括以下步骤：

(ⅰ)用鳗弧菌感染大黄鱼幼鱼后，提取其rna并反转录成cdna，其核苷酸序列如seqidno:1所示；

(ⅱ)设计引物对如seqidno:2所述的正向引物和如seqidno:3所示的反向引物，以cdna为模板进行pcr扩增反应；

(ⅲ)经琼脂糖凝胶检测，对目的条带清晰无杂带的pcr产物进行测序，筛选得到上述snp位点。

步骤(ⅱ)中，所述pcr扩增反应体系为：正向引物(10um)和反向引物(10um)各1ul、cdna模板1ul和无菌水9.5ul；和/或

所述pcr扩增反应的程序依次为：95℃预变性5min、94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s(45个循环)和72℃延伸10min。

本发明还提供了上述与大黄鱼抗鳗弧菌相关的snp位点在抗鳗弧菌大黄鱼遗传育种上的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明对大黄鱼免疫相关基因非同义突变snps进行筛选与验证，snps标记不仅可以评估大黄鱼遗传多样性，而且为大黄鱼的抗病选育等工作提供研发基础。同时，本发明检测到大黄鱼il-6r基因与鳗弧菌抗性相关的snps，为大黄鱼的抗菌选育工作提供新思路，有利于推进大黄鱼的遗传育种进程，提高大黄鱼养殖经济效益。

附图说明

图1是大黄鱼il-6r基因的snp位点峰型图，自上而下依次为对照组、鳗弧菌易感组和抗鳗弧菌组。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

1.与大黄鱼抗鳗弧菌相关的snp位点的筛选

以下实施例中详细解释说明与大黄鱼抗鳗弧菌相关的snp位点的筛选方法，步骤如下：

(1)大黄鱼暂养、驯化

出膜40天、1～2cm的大黄鱼苗取自象山港水产引种育种有限公司，在水温26℃、水深1m、1.0m(内径)×1.2m(高)的养殖桶里暂养3～4天，每天投饵2次(早上7:00、下午6:30)，换水2次，每次换水90％，清理底部食物残渣及粪便。为了防止大黄鱼患白点病，换水时加入少量甲醛并维持水体中甲醛浓度为0.005‰。待鱼苗适应环境、进食稳定后，将暂养的大黄鱼苗移入实验缸中进行实验。

(2)人工感染

实验水体为长80cm、宽45cm的玻璃缸，加入海水70l，每缸放苗500尾，水温控制在26℃，鱼苗稳定后，进行实验；设置对照组和浓度为1.5×10⁸cfu/ml的鳗弧菌感染实验组，实验组和对照组均设置3个平行组。各缸每隔24h投喂一次饵料，清理掉食物残渣和粪便，换水1/3，并补充感染菌以维持其恒定的浓度。每天清理、记录各缸中死苗数，rna保护液保存死亡样本用于后续pcr验证。

(3)pcr扩增及测序

选择对照组、鳗弧菌感染第四天死亡、第七天存活的大黄鱼，分别提取全鱼的总rna。以提取的rna为模版用takara公司的primescript^tmii1^standcdnasynthesiskit反转录成cdna，-20℃保存备用。

设计引物对的序列如下所示：

primerf：acctttggccgtccgcgttac

primerr：gcctggtcatcactactgtggg。

再用上述引物进行pcr扩增，pcr反应体系25ul：12.5ul2×taqplusmastermix(dyeplus)(诺唯赞公司)：primerf(10um)和primerr(10um)各1ul、cdna模板1ul，无菌水9.5ul。扩增反应器为eppendorfpcr仪(德国)。pcr反应程序：95℃预变性5min，94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s(45个循环)，72℃延伸10min。

经琼脂糖凝胶检测、目的条带清晰无杂带的pcr产物送上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序峰图中对应位置仅有g峰，则该个体基因型为gg，若为g和c双峰，则该个体基因型为g/c，若仅有c峰，则该个体基因型为cc，如图1所示。

(4)il-6r基因snp位点

选择大黄鱼对照组样本19尾、鳗弧菌易感组(鳗弧菌感染第四天死亡)样本19尾、抗鳗弧菌组(鳗弧菌感染第七天存活)样本16尾进行snp位点的基因型进行统计，用spss18.0软件对对照组大黄鱼和抗鳗弧菌组样本，鳗弧菌易感组和抗感组样本的基因型统计结果进行单因素方差分析(p<0.05：显著性差异；p<0.01：极显著差异)，保留具有显著性差异的snp位点，最终获得il-6r基因第1021位的snp位点在对照组与抗鳗弧菌组中存在显著性差异，如表1所示。

表1：il-6r基因在鳗弧菌实验组snp位点统计

注：x²0.05<5.991，无显著性差异；5.991<x²0.01<9.21(p<0.05)，显著性差异；x²>9.21(p<0.01)，说明有极显著性差异。

由表1可以看出，与大黄鱼抗鳗弧菌关联的snp分子标记，位于基因il-6r基因上如seqidno:1所示碱基序列的1021bp位置，碱基g突变成c，导致氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，对照组大黄鱼基因型为gg为57.9％、gc为42.1％、cc为0；鳗弧菌易感组大黄鱼基因型频率为gg为84.3％、gc为15.8％、cc为0；抗鳗弧菌组大黄鱼基因型频率为gg为18.8％、gc为68.8％、cc为12.5％。

对照组和抗鳗弧菌组大黄鱼位点il-6r-1021-g/c分型的显著性检验结果x²＝6.838>5.991，p<0.05，鳗弧菌易感组与抗感组此位点x2＝15.322>9.21>5.991，p<0.01，表明在此位点上对照组和抗鳗弧菌组大黄鱼样本间基因型分布具有显著差异，鳗弧菌易感抗感群体间基因型分布具有极显著差异，此位点与大黄鱼抗鳗弧菌相关。

2.与大黄鱼抗鳗弧菌相关的snp位点在遗传育种中的应用

将上述筛选方法得到的snp位点用于选育抗鳗弧菌大黄鱼，步骤为：

利用上述筛选方法筛选出snp位点il-6r-1021-g/c为cc纯合的大黄鱼为父本和母本进行人工育种，建立snp位点il-6r-1021-g/c为cc纯合的大黄鱼家系，则其后代为抗鳗弧菌率高的苗种。

与现有大黄鱼抗菌育种技术相比，本发明从基因角度出发，筛选到与大黄鱼抗鳗弧菌相关的snp位点，并把此位点运用在大黄鱼育种工作中，有望从遗传角度根本性的解决大黄鱼患弧菌病问题。

序列表

<110>上海海洋大学

<120>一种与大黄鱼抗鳗弧菌关联的snp位点、其筛选方法和应用

<141>2019-11-18

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1206

<212>dna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>1

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