Bccys6-2蛋白在调控灰霉菌的生长、分生孢子生成和致病能力中的应用

bccys6-2蛋白在调控灰霉菌的生长、分生孢子生成和致病能力中的应用
技术领域
1.本发明涉及bccys6-2蛋白在调控灰霉菌的生长、分生孢子生成和致病能力中的应用。


背景技术：

2.灰霉菌(botrytis cinerea)是一种典型的死体营养型植物病原真菌，引发植物的灰霉病。灰霉菌寄主范围非常广泛，可侵染1000多种植物，可以从植物的茎、叶、花和果实等多个地上部位进行侵染，其在成熟和衰老的植物组织上表现出更强的致病力。
3.灰霉菌是葡萄、草莓、番茄、黄瓜和一些观赏花卉等重要经济作物上危害最为严重的病原菌之一。世界范围内的调查表明灰霉菌的危害和重要性在所有植物病原真菌中高居第二，仅次于稻瘟菌，是果实采后第一大病原真菌。据统计，灰霉菌每年在世界范围内造成的经济损失高达100亿到1000亿美元。
4.目前对灰霉病的防治仍然是以化学药剂防治为主，每年投入巨大。然而，由于灰霉菌遗传变异较快及侵染方式多样化等原因，导致其易产生抗药性，化学防治的效果并不理想。因此，生产上急需针对灰霉病的更有效的防治策略，而这需要建立在对灰霉菌的致病机制深入理解的基础上。灰霉菌的分生孢子是其最主要的传播和侵染源，可以通过无性繁殖过程产生。分生孢子成熟后从分生孢子梗脱落，借气流、雨水、露珠或农事操作进行传播。分生孢子萌发时产生芽管，从寄主伤口或衰老的器官及枯死的组织上侵入。因此，分生孢子的产生与否或产量的多少直接影响灰霉病的流行程度和严重度。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供bccys6-2蛋白在调控灰霉菌的生长、分生孢子生成和致病能力中的应用。
6.本发明提供了用于敲除灰霉菌中编码bccys6-2蛋白的基因的物质在防治灰霉菌中的应用。
7.本发明还保护用于敲除灰霉菌中编码bccys6-2蛋白的基因的物质在防治灰霉病中的应用。
8.本发明还保护用于敲除灰霉菌中编码bccys6-2蛋白的基因的物质的应用，为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)：
9.(a1)降低灰霉菌的致病性；
10.(a2)抑制灰霉菌分生孢子形成；
11.(a3)抑制灰霉菌生长。
12.本发明还保护bccys6-2蛋白的应用，为如下(b1)和/或(b2)和/或(b3)：
13.(b1)调控灰霉菌的致病能力；
14.(b2)调控灰霉菌分生孢子形成；
15.(b3)调控灰霉菌生长。
16.本发明还保护一种制备重组灰霉菌的方法，包括如下步骤：敲除灰霉菌中编码bccys6-2蛋白的基因，得到致病性降低的重组灰霉菌。
17.本发明还保护一种重组灰霉菌，是敲除灰霉菌中编码bccys6-2蛋白的基因得到的，致病性降低的重组灰霉菌。
18.以上任一所述敲除灰霉菌中编码bccys6-2蛋白的基因，可为敲除灰霉菌中编码bccys6-2蛋白的基因的整个编码区。以上任一所述敲除灰霉菌中编码bccys6-2蛋白的基因，可为敲除灰霉菌中编码bccys6-2蛋白的基因的部分区段。以上任一所述敲除灰霉菌中编码bccys6-2蛋白的基因，可为敲除灰霉菌基因组dna中序列表的序列3中第498-2396位核苷酸。以上任一所述敲除灰霉菌中编码bccys6-2蛋白的基因，可为用具有抗性基因片段的dna分子取代灰霉菌基因组dna中序列表的序列3中第498-2396位核苷酸。所述具有抗性基因片段的dna分子具体可如序列表的序列4中第1073-3413位核苷酸所示。
19.以上任一所述敲除灰霉菌中编码bccys6-2蛋白的基因可通过同源重组实现。以上任一所述敲除灰霉菌中编码bccys6-2蛋白的基因可通过导入序列表的序列4所示的dna分子实现。
20.本发明还保护编码bccys6-2蛋白的基因作为被敲除靶点，在防治灰霉菌中的应用。
21.本发明还保护编码bccys6-2蛋白的基因作为被敲除靶点，在防治灰霉病中的应用。
22.本发明还保护用于bccys6-2蛋白丰度或用于抑制bccys6-2蛋白活性的物质在防治灰霉菌中的应用。
23.本发明还保护用于降低bccys6-2蛋白丰度或用于抑制bccys6-2蛋白活性的物质在防治灰霉病中的应用。
24.本发明还保护用于降低bccys6-2蛋白丰度或用于抑制bccys6-2蛋白活性的物质的应用，为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)：
25.(a1)降低灰霉菌的致病性；
26.(a2)抑制灰霉菌分生孢子形成；
27.(a3)抑制灰霉菌生长。
28.以上任一所述bccys6-2蛋白为如下(c1)或(c2)或(c3)：
29.(c1)序列表中序列1所示的蛋白质；
30.(c2)将(c1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与灰霉菌致病性相关的蛋白质；
31.(c3)来源于灰霉菌且与(c1)具有98％以上同一性且与灰霉菌致病性相关的蛋白质。
32.以上任一所述编码bccys6-2蛋白的基因具体可为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：
33.(d1)序列表中序列2所示的dna分子；
34.(d2)序列表中序列3所示的dna分子；
35.(d3)来源于灰霉菌且与(d1)或(d2)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的dna分子；
36.(d4)在严格条件下与(d1)或(d2)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的dna分子。
37.上述严格条件可为用6
×
ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2
×
ssc，0.1％sds和1
×
ssc，0.1％sds各洗膜一次。
38.以上任一所述灰霉病为灰霉菌引起的植物病害。
39.以上任一所述灰霉菌具体可为灰霉菌b05.10。
40.本发明对于灰霉病的防控具有重大的应用推广价值。
附图说明
41.图1为实施例2中生长速率的检测结果。
42.图2为实施例2中产孢量的检测结果。
43.图3为实施例2中致病力的检测结果。
具体实施方式
44.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
45.将来源于灰霉菌的序列表的序列1所示的蛋白质命名为bccys6-2蛋白(687aa)。灰霉菌的cdna中，编码bccys6-2蛋白的开放阅读框如序列表的序列2所示(2064bp)。灰霉菌的基因组dna中，bccys6-2基因如序列表的序列3所示(3040bp)。bccys6-2蛋白的分子量为77.26kda。
46.灰霉菌b05.10(botrytis cinerea b05.10)，野生灰霉菌，用wt表示，记载于如下文献：segm
ü
ller n,kokkelink l,giesbert s,odinius d,van kan jal,tudzynski p.2008.nadph oxidases are involved in differentiation and pathogenicity in botrytis cinerea.mol plant microbe interact,21,808-819.。
47.实施例1、bccys6-2敲除突变体的制备
48.1、制备序列表的序列4所示的dna分子。
49.序列表的序列4中，第1-1072位核苷酸是从灰霉菌b05.10的基因组dna中扩增得到的上游同源臂，第1073-3413位核苷酸中具有潮霉素抗性基因片段，第3414-4264位核苷酸是从灰霉菌b05.10的基因组dna中扩增得到的下游同源臂。
50.2、将步骤1得到的融合片段导入灰霉菌b05.10，通过抗性筛选(50μg/l潮霉素b)获得重组菌。
51.3、将步骤2得到的重组菌的基因组dna作为模板，进行pcr鉴定。
52.pcr鉴定采用的引物对如下(如果得到约1638bp的扩增产物，鉴定为阳性)：
53.正向引物：ttccctatcttacccattctc；
54.反向引物：ttgtttgctggttacgcttt。
55.4、将pcr鉴定为阳性的重组菌进行测序验证。与灰霉菌b05.10相比，重组菌的基因组dna的差异仅在于将序列表的序列3中第498-2396位核苷酸替换为了序列表的序列4中第
1073-3413位核苷酸。将该重组菌命名为bccys6-2敲除突变体，又称灰霉菌
△
bcc6-2，用
△
bcc6-2表示。
56.实施例2、野生灰霉菌与bccys6-2敲除突变体的比较
57.供试菌为：灰霉菌b05.10或灰霉菌
△
bcc6-2。
58.一、生长速率
59.将供试菌接种至pda培养基平板，22℃静置培养，分别于培养1天后、2天后和3天后测量菌落直径。每种供试菌设置5个生物学重复。
60.培养3天后的照片见图1a。菌落直径见图1b。与灰霉菌b05.10相比，灰霉菌
△
bcc6-2的生长速率显著降低。培养2天后，灰霉菌
△
bcc6-2的菌落直径比灰霉菌b05.10小31.4％。培养3天后，灰霉菌
△
bcc6-2的菌落直径比灰霉菌b05.10小33.7％。
61.二、产孢量
62.将供试菌接种至pda培养基平板，22℃静置培养14天，然后检测分生孢子的产量。每种供试菌设置5个生物学重复。
63.培养14天后的照片见图2a。培养14天后，平均每个平板的分生孢子数量见图2b。灰霉菌b05.10的孢子产量达到5.25
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107个，而灰霉菌
△
bcc6-2完全丧失了产生分生孢子的能力。这说明bccys6-2基因是调控灰霉菌分生孢子产生的关键基因。
64.三、致病力
65.用无菌接种针在苹果果实(红富士)的腰部刺伤，晾干后用移液枪在刺伤部位注射10μl孢子悬浮液(用液体pdb培养基悬浮供试菌的分生孢子，得到5
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103个孢子/ml的孢子悬浮液)，之后将苹果果实置于灭菌后的塑料筐内，用保鲜袋密封保湿，25℃放置。每隔24h统计发病率和病斑直径，并拍照记录。
66.每种供试菌设置5个生物学重复。
67.注射孢子悬液后第3天、第4天和第5天的苹果照片见图3a。注射孢子悬液后第3天、第4天和第5天的病斑直径见图3b(每天的两个柱形数据中，左侧对应wt，右侧对应
△
bcc6-2)。接种4天和5天后，灰霉菌
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bcc6-2形成的病斑直径均比灰霉菌b05.10形成的病斑低31％。这说明bccys6-2基因是调控灰霉菌致病力的关键基因，bccys6-2基因敲除导致其致病力的显著降低。